多形性胶质母细胞瘤（Glioblastomamultiforme，GBM）是最为致命的原发性脑肿瘤，具有复杂的血管网络、高度的细胞及分子异质性。快速、灵活的构建基于特定患者生物物理异质性的GBM模型，对研究GBM发病机制、个性化药物筛选有重要意义。
近期，加利福尼亚大学圣地亚哥分校纳米工程系（UniversityofCalifornia,SanDiego）的ShaochenChen团队在SMALL上发表了题为“Rapid3DBioprintingofGlioblastomaModelMimickingNativeBiophysicalHeterogeneity”的文章。该团队利用基于数字光处理（DLP）的生物打印技术，打印了患者来源的细胞及透明质酸（hyaluronicacid(HA)）衍生物。快速、灵活的构建了可重复的具有生物物理异质性的GBM模型，并研究了细胞与其所处生物物理环境间的相互作用。该模型在研究GBM发病机理及个性化药物筛选方面有重大意义。
胶质母细胞瘤是最为致命的中枢神经系统（CNS）癌症，患者存活时间的中位数仅为14.6个月。GBM具有复杂的血管网络、高度的异质性和耐药性，且常成弥散性分布，这对GBM的治疗带来了巨大挑战。GBM具有独特且复杂细胞外基质（ECM），其肿瘤微环境（TME）内细胞分泌的蛋白酶会不断重塑ECM，使ECM的生物物理特性及成分改变。这种变化也将通过ECM与细胞的相互作用影响细胞，进而影响GBM的发生、发展、侵袭和迁移。目前，已有很多利用ECM衍生材料对ECM与肿瘤细胞相互作用机制的研究。研究发现，ECM的生物物理特性（如硬度、几何形状等）能调节细胞基因表达、调控细胞行为。细胞也会作用于ECM并重塑微环境。这种ECM与肿瘤细胞间的动态相互作用已被证实能使多种肿瘤的组织硬化。但利用传统的组织工程技术很难在体外精确创建生物物理环境以研究其和GBM肿瘤细胞的相互作用。此外，GBM血管生成能力强，血管的生成促进了GBM的生长和迁移。但在现有的刚度模型中，用于研究GBM血管化的模型尚未建立。
为了建立有效的体外肿瘤模型，人们常用生物3D打印技术，生物3D打印技术能在肿瘤区域周围建立基质层，模拟肿瘤的细胞异质性。但包括GBM在内的多种癌症的发生和发展还和ECM的生物物理特性有关。目前，大多数模型还依赖多种水凝胶材料或不同的合成材料对肿瘤微环境进行建模，合成材料的使用降低了模型的仿生性能；多种水凝胶材料会导致模型的不连续。基于数字光处理（DLP）的生物打印技术是一种和光敏生物材料兼容的快速生物制造技术，该技术可以用来建立具有特定生物物理特性的GBM模型，研究GBM的发生、发展过程。该团队利用DLP技术，打印了患者来源的细胞及透明质酸（hyaluronicacid(HA)）衍生物。通过调节打印参数和生物材料浓度，该团队可以在相同材料下构建具有不同硬度分布的GBM三维模型。生物物理异质性的模拟，使该模型具有了更好的仿生结构。在模型建立后的两周，肿瘤相关过程逐步发生：肿瘤相关基因表达、细胞形态变化、血管化、转移。刚性较高的ECM微环境诱发了GBM治疗效果差及复发时的间质表型；刚度较低的ECM微环境促进了细胞的增殖和扩张；添加内皮细胞（HUVEC）的共培养模型还诱导了GBM细胞的耐药相关基因表达。这都说明该模型在研究GBM发生发展机制及耐药性方面有潜在价值。
1．通过DLP技术打印具有局部生物物理特性的GBM模型
为探究空间上ECM异质性对GBM和内皮细胞的影响。该团队使用DLP技术，结合患者来源的肿瘤细胞和ECM衍生生物墨水（包括甲基丙烯酸缩水甘油酯透明质酸（GMHA）和甲基丙烯酸明胶（GelMA））打印了四种不同的模型：只有肿瘤的硬模型、只有肿瘤的软模型、共培养硬模型和共培养软模型（图1A）。
图1通过DLP技术打印具有局部生物物理特性的GBM模型
考虑到氧气和营养物质的扩散，取模型厚度为μm。每个模型用直径μm的GBM细胞形成肿瘤区（TumorRegion），并用环形宽度为μm的无细胞ECM区（ECMregion）包裹。对共培养模型，用含有人脐血管内皮细胞（HUVECs）打印并包裹其它区域形成内皮区（Endothelialregion）（图1B）。肿瘤区和内皮区的基质硬度分别为7kPa、0.45kPa，以模拟患者体内的实际情况。对ECM区，设计了两种硬度，分别为21kPa（硬模型）和2kPa（软模型），以模拟GBM组织硬度和健康大脑密度（图1C）。在37℃、5%CO2条件下培养一周，使用显微镜（明场显微镜及扫描电子显微镜（SEM））观察硬模型和软模型ECM区（图1D），可以看出硬模型ECM区的孔径明显小于软模型ECM区的孔径。
2．对比球形培养、仅肿瘤软、硬模型培养下GBM的转录谱
使用只有肿瘤的模型对肿瘤发生发展过程进行研究。研究人员对比了球形培养和软、硬3D培养下肿瘤细胞的转录特征。利用RNA测序（RNAseq)技术对球形培养及两种3D培养条件下的TSGBM进行了转录谱分析。结果显示，同任一3D培养模型相比，球形培养的GBM具有明显不同的转录谱，而两种3D培养模型的GBM转录谱相近（图2A）。一些编码癌症相关基因或预后基因的蛋白质在两种3D培养条件下均显著上调，部分基因（如CYP24A1、DIRAS2、KANK4等）在两种3D培养条件下下调，但在球形培养物中富集（图2B，C），这说明球形培养和3D培养的GBM具有显著差异。利用RNAseq结果进行基因本体（GO）富集分析，以研究不同培养条件下肿瘤细胞生物学过程和分子功能的变化（图2D，E）。发现同球形培养相比，3D培养条件下细胞间通过浆膜粘附分子（plasmamembraneadhesionmolecules）进行粘附的比例都过高，说明用于打印的仿ECM材料促进了细胞粘附和细胞串扰。DNA复制、细胞周期调控和细胞分裂的分析结果也表示：与球形培养相比，3D软模型中肿瘤细胞的增殖增强；整合素介导的细胞粘附，细胞-底物粘附等在3D硬模型中出现更多。而球形培养条件下与信号传导及代谢相关的途径增多。
图2对比球形培养与3D软、硬培养条件下GBM的转录谱
3D模型中细胞基因表达的变化是ECM的生物物理性质及该模型下的细胞间相互作用共同导致的结果。同时，3D软、硬模型的差异表明：硬微环境可能增强了细胞对ECM的反应。
3．探究基质刚度对GBM缺氧及致瘤性的影响
进一步对比3D软、硬模型中GBM细胞的转录谱及相关标记物（图3）。在3D硬模型中，缺氧相关血管生成标志物（VEGFA及SPP1）上调（图3C），癌症侵袭、迁移及对外部刺激响应的相关基因表达更加丰富。表明硬模型促进了GBM缺氧，增强了其致瘤性。在3D软模型中，与细胞周期调控的相关基因组上调（图3A，B），免疫荧光（IF）染色显示，软模型中存在更多的KI67阳性细胞（图3D）。表明软模型中的GBM细胞具有更强的分化及增殖能力。
图33D软、硬模型中GBM的转录谱和蛋白分析、侵袭能力对比
4．探究该模型诱导的不同GBM侵袭模式和转录亚型
在培养的第7天，通过荧光标记方法观察3D软、硬模型中GBM的迁移（图3E），发现软模型中的细胞迁移能力更强。同时，软模型中TS细胞和CW细胞的侵袭面积分别比硬模型高7倍和4.4倍（图F）。表明较低的ECM基质刚度对肿瘤迁移有促进作用。与从软模型分离的TS细胞相比，从硬模型分离的TS细胞具有高度富集的原代GBM组织特征（图3G），表明硬模型培养条件下，细胞更具临床相关状态。
5．探究共培养模型中GBM的血管化
接下来，该团队通过共培养软、硬模型研究了GBM中肿瘤细胞和内皮细胞的相互作用。两种模型都观察到HUVEC向GBM细胞迁移。在硬模型中，迁移的CD31＋HUVEC呈现出芽血管样形态，并与SOX2+GBM细胞密切接触（图4A）；在软模型中，HUVEC呈现出铺展形态，没有明显的出芽（图4A）。对几种培养方法下的肿瘤细胞进行定时定量PCR（qPCR）分析，发现血管生成标志物SPP1和VEGFA在所有培养方法下都上调，但在共培养硬模型中上调最多（图4B）。这些都表明ECM刚度越高，越有利于GBM的血管化。
图4共培养软、硬模型的血管化及药物测试
6．探究GBM-内皮细胞相互作用对肿瘤侵袭和耐药性的影响
之后，该团队探究了共培养条件对GBM侵袭的影响。共培养模型中的GBM具有不同的侵袭模式，在共培养软模型中，肿瘤以纤维状扩张；在共培养硬模型中，肿瘤以相对圆润的形态扩张（图4C）。
最后，该团队对几种培养模式下的GBM耐药性进行了研究。采用μM的TMZ处理几种样品6天（图4D），相比球形培养，3D打印模型中培养的肿瘤细胞对替莫唑胺（temozolomide，TMZ)的耐药性增强。只有肿瘤的软、硬模型相比，其细胞耐药性无明显差异。共培养软、硬模型中，共培养提高了硬模型中细胞对TMZ的耐药性，但软模型中的耐药性基本不变。在排除了ECM刚度对药代动力学的影响后，采用qPCR技术对几种培养模式下的耐药相关基因进行分析，结果表明：在共培养硬模型中，耐药相关基因如ABCG2和CXCL12分别上调8倍和24倍（图4E），与TMZ治疗反应一致。说明，较高的ECM刚度将会增强GBM的耐药性。
文章利用基于数字光处理（DLP）的生物打印技术，打印了患者来源的细胞及透明质酸（hyaluronicacid(HA)）衍生物，快速、灵活的构建了可重复的具有生物物理异质性的GBM体外模型，并研究了细胞与其所处生物物理环境间的相互作用。通过对比球形培养，对几种模型下培养的肿瘤细胞进行了转录谱及蛋白分析，探究了ECM基质刚度对GBM发生发展过程的影响，并对比了不同模型中GBM肿瘤细胞对TMZ的耐药性。该模型在研究GBM发病机理及个性化药物筛选方面有重大意义。
Tang,M.,S.K.Tiwari,K.Agrawal,M.Tan,J.Dang,T.Tam,J.Tian,X.Wan,J.Schimelman,S.You,Q.Xia,T.M.Rana,andS.Chen..Rapid3dBioprintingofGlioblastomaModelMimickingNativeBiophysicalHeterogeneity.Small(Jan27):e.