原代培养又称初代培养，是指直接从机体内获取组织或细胞，接种培养至第一次传代阶段。一般持续1～4周。原代培养的细胞有贴壁生长和悬浮生长两种。贴壁培养是根据胰酶的消化原理，使细胞间的蛋白质水解，细胞离散，然后加入适量的培养液，置于合适的容器内，在一定的温度下进行培养。由于原代培养的细胞离体时间短，其遗传性及细胞生物学特性与机体内细胞相似，故适于进行细胞形态结构、细胞分化、药物测试等方面的研究。人和动物的大部分组织都可进行培养，幼体的组织和细胞更适于进行原代细胞培养。
（一）操作步骤
1.剪切组织 先将所取组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入小容器中，加入适量缓冲液，用眼科剪反复剪切成糊状。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当缓冲液再清洗一次。
2.消化分离 目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散成单个细胞，以利于进一步培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3.培养 细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液调整为（2～5）×cells/mL，分装于细胞瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5%CO2，37℃静置培养。一般3～5天原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加1/2原培养液量的新培养液，继续培养2～3天后换液，一般7～11天可以长满瓶壁，进行传代。
（二）注意事项
1.无菌操作 细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念。
2.培养液 所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有所差异。
3.小牛血清 对于维持细胞生存和促进细胞增殖起着关键作用，确定某厂家某一批号的小牛血清，就保持应用。
4.胶原酶溶液 必须新鲜配制，贮存时间过长，即使是-20℃保存，也将影响消化效力，导致消化时间过长而损伤细胞。
5.L-谷氨酰胺 几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。谷氨酰胺在培养液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱贮存2周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。
6.静置培养 原代细胞在消化分离后，置于CO2培养箱的头24～48小时（必要时72小时）内，应处于绝对静置状态，切忌不时地取出培养瓶观察生长状况，这将使原代培养细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增殖。初学者尤应注意，不必担心培养液中的营养成分会消耗光，细胞在增殖之前对营养的需求并不大。
7.消化时间 一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已经松散，略加吹打即成细胞团或单个细胞，过久消化往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低。