撰文
图南
#干细胞#
在哺乳动物的早期胚胎发育过程中，受精卵通过一系列的细胞分裂分化形成多细胞的早期胚胎，在着床之前历经桑椹胚（morula）和囊胚（blastocyst）等时期。在囊胚时期，胚胎具有三个谱系，滋养外胚层（trophectoderm）、下胚层（hypoblast）以及上胚层（epiblast），其中滋养外胚层与下胚层进一步发育为胚外组织，如胎盘，卵*囊，而上胚层最终发育成为个体。而小鼠胚胎干细胞根据来源不同，可以分为nave（原始）状态及primed（始发）状态。Nave状态的干细胞来源于着床前的胚胎，具有更高的多能性，能够分化得到胚外组织。而primed状态的干细胞主要来源于着床之后的上胚层细胞，因此也被称为EpiESC。传统的人胚胎干细胞一般被认为是出于primed状态，具有较高的DNA甲基化水平，维持一条X染色体的失活状态，以及使用近端的增强子（proximalenhancer）来维持OCT4的表达水平。在年到年间，多个课题组发现可以通过调控细胞信号传导途径将人胚胎干细胞从primed状态逆转至处于发育更早期的nave状态。更为重要的是，近期多项研究发现nave状态的确具备更高的多能性。比如AustinSmith博士等课题组发现，与小鼠类似，只有nave状态的人胚胎干细胞才具有分化成滋养外胚层的潜能。吴*博士课题组基于nave状态的人胚胎干细胞构建了早期人造囊胚模型。
然而，目前已有的nave人胚胎干细胞的培养体系依然存在一定的缺陷。NHEM体系得到的nave状态仍具有较高的DNA甲基化水平，而5iLA虽然能够快速的去DNA甲基化，却伴随着印记基因的去甲基化及基因组的不稳定性。同时，5iLA体系需要将干细胞培养在饲养细胞（Feedercell）上。
年4月28日，来自WeissmanInstitute的JacobH.Hanna博士等课题组在CellStemCell上发文Principlesofsignalingpathwaymodulationforenhancinghumannaivepluripotencyinduction，进一步优化了nave人胚胎干细胞的培养条件，得到增强型的feederfree的nave人胚胎干细胞。
早期研究发现，DNA的甲基化及RNA的甲基化对于primed状态的人胚胎干细胞至关重要。相关的甲基化酶（DMNTs/METTL3）的敲除会引起细胞死亡，而nave状态的胚胎干细胞却能够存活。根据这个原理，作者利用条件性敲除METTL3的细胞系筛选发现WNT信号通路抑制剂能够显著提高细胞的生存率，增强nave状态的转化效率。随后，作者希望通过进一步筛选小分子来替代ActivinA的功能。他们发现SRC抑制剂能够帮助METTL3敲除的干细胞在没有或者低浓度的ActivinA的培养基中存活。同时，这些细胞也符合nave状态的细胞特性，比如分化至各胚层，包括胚外细胞谱系，以及使用远端增强子来维持OCT4的表达水平等。至此，他们基本建立起了优化的细胞培养体系，称之为HENSM。作者进一步通过RNAseq，ATACseq及全基因组亚硫酸氢盐（Bisulfitesequencing）测序来表征得到的nave状态细胞系。结果表明，HENSM得到的胚胎干细胞的基因表达谱系与之前报道的nave干细胞很相似。与primed干细胞相比，GSEA和ATACseq表明HENSM的细胞与胚胎早期细胞（2细胞，8细胞及桑椹胚及囊胚期）具有更高的相似性。更为重要的是，作者发现HENSM细胞的确逆转了X染色体的失活状态。而当他们将这些细胞注射到早期小鼠胚胎中得到嵌合型胚胎，证明了该细胞的具有发育到多谱系的潜能。
利用该优化的nave细胞模型，作者进一步探究了人和小鼠nave胚胎干细胞的异同。以WNT信号通路为例，多项研究表明WNT对于小鼠胚胎干细胞向nave状态的转变是不可或缺的，而其在人胚胎干细胞nave状态的功能依旧存在争议。作者利用βCAT敲除的细胞进行研究，发现βCAT敲除对于人胚胎干细胞的nave状态转变并没有影响，而CAT的入核却能够抑制其向nave状态转变。除此之外，作者还发现KLF家族的转录因子KLF17对于人胚胎干细胞向nave状态转变至关重要，而对小鼠却没有影响。除了这些不同点之外，小鼠干细胞nave状态转变的研究对于人胚胎干细胞依旧具有一定的借鉴意义。例如，前期研究发现，在一定条件下不使用MEK/ERK抑制剂也能够改变小鼠胚胎干细胞的状态，而且不会引起全基因组的去甲基化，从而提供了更为安全的转变方式。与此类似，作者发现在人胚胎干细胞中抑制Notch信号通路具有类似的效果，能够独立于MEK/ERK信号通路促进nave状态转变。
本研究通过小分子筛选进一步优化了nave状态人胚胎干细胞的培养条件，并且表征了其细胞特性，系统性地研究了不同信号通路对于nave状态的影响，更进一步证实了人与小鼠nave状态干细胞维持的差异性。然而，这些nave状态的人胚胎干细胞的功能性依旧值得深入研究。Primed状态的人胚胎干细胞能否分化得到胚外组织依旧存在一定的争议。而这些筛选得到的信号通路在自然状态下人早期胚胎发育中发挥怎样的功能也值得进一步探讨。
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