初代培养:动物机体各种组织从机体中取出,经各种酶、EDTA或机械法处理,成为单细胞,在培育基中培育,使细胞得以生计、成长和繁衍,这一进程称原代培育,也叫初代培养。
常用的初代培育有组织块培育和分散细胞培育。
组织块培育是将剪碎的安排块直接移植在培育瓶壁上,参加培育基后进行培育。
分散细胞培育则是将安排块用机械法或化学法使细胞涣散。如想从胎儿或新生儿的安排别离到活性较好的游离细胞,经常用的办法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和胶原酶)消化细胞间的结合物,或用金属离子螯合剂(如EDTA)除掉细胞相互粘着所依靠的钙离子,再经机械轻度振动,使之成为单细胞。
试验所需设备:
AlphaClean洁净工作台
HFCO培养箱
AlphaClean洁净作业台、培养瓶、HF二氧化碳培育箱、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、低速离心机、水浴箱(或恒温箱)试验所需试剂:培育基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒试验所需样本:动物安排块初代消化培育法:1、已消*培育用品置于AlhaClean洁净台的净化台面,紫外线消*20分钟;2、开端作业前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部,开启红外灭菌器或酒精灯,装置吸管帽;3、Hank′s液漂洗安排2-3次(把安排块置于烧杯中),去血污(如置疑安排可能污染,先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟);4、用眼科剪将安排切成块(2~3毫米巨细),参加比安排块总量多30-50倍的胰蛋白酶液,同时倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞;5、用恒温水浴或置于37℃恒温箱消化,消化中每隔20分钟摇动一次,消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定;
6、消化进程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少量消化液在镜下观察,如安排已涣散成细胞团或单个细胞,立即停止消化,随即经过不锈钢筛滤掉尚未充分消化开的安排块,低速(~RPM/min)离心消化液5分钟,吸出上清,参加适量含有血清的培育液;7、用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培育液调整后,分装入培育瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培育液呈微红色,如色彩偏*,阐明液体变酸,可用NaHCO调整;8、放置于CO培育箱中培育箱,温度为:36.5℃,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽阻塞,每次换液时需求换新塞。