治疗白癜风哪个医院最专业 https://wapjbk.39.net/yiyuanfengcai/yyjs_bjzkbdfyy/细胞复苏、传代与冻存操作流程：
仪器与试剂
操作流程:复苏
1）将恒温水浴锅中的水预热到37℃；
2）准备一支15ml离心管，加入5ml含10%FBS的wan全培养基，放入37℃水浴锅中预热；
3）戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；
4）将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准中，混匀后，rpm离心5min；
5）准备一个T-25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4mlwan全备的离心管培养基；
6）离心完成后弃去上清，用1mlwan全培养基重悬细胞后，转入T-25细胞培养中，混匀后转入O2培养箱中培养静置。
注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。
传代（细胞传代建议一传二）
1.当细胞汇合度达到85%以上时，可进行传代。
2.在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
3.向培养瓶内加入3ml无菌的1×PBS后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS；
4.向瓶内加入消化液1ml，浸润底面后放入37℃CO2培养箱中孵育1~2min；
5.孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2ml含10%FBS的完全培养基中，将悬液吸入15ml离心管；
注：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：
①准备一个无菌的15ml离心管，加入2ml含10%FBS的wan全培养基；
②将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；
③向之前消化的培养瓶中加入1ml胰酶继续消化2min左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2ml含10%FBS的wan全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。
6.rpm离心5min；
7.准备两个新的T-25培养瓶，各加入4mlwan全培养基。
8.离心完成后，弃上清，用2mlwan全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T-25培养瓶，每个培养瓶各1ml；
9.水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。
冻存（细胞冻存建议每瓶T25冻一支）
1~6）参照传代步骤
7）离心完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8ml冻存管中；
8）将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
9）第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。
