根据国家癌症中心发布的《中国癌症报告》，年，全国恶性肿瘤新发病例数.4万例，相当于平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7个人被确诊为癌症。面对逐年增长的癌症患者数量，肿瘤成为研究学者不断攻坚的对象，迫切希望找到更好的治疗方式。美国的BruceA.Beutler、卢森堡的JulesA.Hoffmann以及加拿大的JulesA.Hoffmann三位科学家因在免疫学方面的发现获得年诺贝尔生理学或医学奖，他们革新了我们对免疫系统的认识，为疾病的治疗开辟了新的方式。免疫治疗成为对癌症治疗的新型治疗手段。其中，CAR-T（ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy）在白血病和淋巴瘤患者身上取得了巨大的临床成功，导致该领域的研究呈指数级增长。年，国内首款CAR-T产品上市，标价万人民币。此前国际上已有多款CAR-T的药物上市，价格也均十分高昂。
CAR-T全球上市产品这里，小优想给大家分享年3月发表于Nature杂志上的一篇影响因子高达53分的文章，接下来小优带大家一起看看吧。RecentadvancesanddiscoveriesinthemechanismsandfunctionsofCARTcells本篇文章给大家展示了过去3年中嵌合抗原受体(CAR)T细胞在功效和安全性等方面的主要进展和变化，CAR的各种分子模块如何影响信号传导和功能，在CAR-T治疗过程中会发生的毒副作用以及如何干预以最大程度的降低毒副作用。接下来我们一起沿着文章的思路去看看吧。1、CAR-T的结构CAR-T治疗又称嵌合抗原受体T细胞治疗，是将人的T细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，从而可特异性识别和结合肿瘤细胞表面的抗原并实现对肿瘤细胞的特异性杀伤，将其回输患者体内，用于治疗疾病。
图1CAR-T细胞治疗（图1引自TheapplicationofCAR-Tcelltherapyinhematologicalmalignancies:advantagesandchallenges）
CAR-T之所以有这么强大的功能，被用于治疗各种疾病，主要在于它的结构。嵌合抗原受体T细胞是抗体的单链可变区域（scFv)与T细胞表面受体嵌合于T细胞上，主要由三部分组成，即胞外区、跨膜区和胞内区域。胞外区常为单链抗体（scFv)，负责识别并结合靶抗原；跨膜区是铰链或间隔区，可将scFv锚定于细胞膜上；胞内信号域由共刺激因子和CD3信号域组成。当抗原被识别和结合后，产生刺激信号传至胞内信号域，T细胞被激活并发挥效应功能。
图2CAR-T的结构
没有什么事情是一蹴而就的，CAR-T的结构也是在不断进步和完善过程中。最早出现的CAR被称为第一代CAR，仅由一个胞内信号域组成。然而，由于它的结构中缺乏细胞增殖的第二信号，导致由它介导的T细胞特异性结合肿瘤抗原后无法进行进一步的增殖，因此，第一代CAR的抗肿瘤作用很弱，在体内作用时间很短，最终导致T细胞的凋亡。因此研究人员尝试设计改造CAR受体，在第一代的基础上成功设计出第二代CAR，增加了一个共刺激信号的活性结构域。随着共刺激信号域的加入，T细胞上的第二刺激信号被激活，上游的信号从而被无限扩大，从而促进T细胞的增殖，白介素IL-2的合成和表达，部分抗凋亡蛋白的分泌。也就是说，CART细胞在杀死肿瘤细胞的同时，也实现了其自身的无限扩增。然而却发现在外源的共刺激信号不存在时，上述作用均无法正常进行。为了进一步优化CAR的结构，研究人员开始着眼于第三代CAR的开发，在包含胞内信号域、共刺激信号活性结构域的基础上，增加了额外的共刺激信号。而第三代CAR-T细胞的体内扩增能力、杀伤能力及细胞因子释放能力均明显提高。
图3第一代至第三代CAR-T（图3引自DifferentSubsetsofTCells,Memory,EffectorFunctions,andCAR-TImmunotherapy）
第一代CAR只有一个激活域，胞外抗原识别区即单链可变片段（scFv）融合跨膜区和T细胞受体（TCR）CD3ζ分子胞内信号域组成；第二代CAR包含一个共刺激域，其衍生自CD28或4-1BB结构域，位于跨膜区和CD3信号传导域之间；第三代CAR具有一个激活域和两个共刺激域。胞外域由抗体衍生的抗原结合scFv（单链可变片段）与重链可变片段VH和轻链可变片段VL组成，它们通过接头连接。铰链区将ScFv与跨膜连接领域。内域由共刺激域（CD28；CD或4-1BB）和激活域组成：CD3zeta。最新的研究表明CAR-T细胞的活性与靶细胞提供的内源性受体也有一定的关系，特别是当它们产生额外的蛋白质分子，如细胞因子，或拥有额外的受体，如共刺激配体时，因此CAR的结构也是在不断的完善过程中。那了解了CAR-T的进化史接下来我们一起来看看它的生产过程吧。2、CAR-T的生产CAR-T细胞的生产过程包括T细胞的初始分离和富集，CART细胞制备，包括T细胞活化，T细胞扩增，使用病毒或非病毒载体进行CAR载体的基因转移。病毒载体系统，然后离体CART细胞扩增。最终的细胞产物需要进行后期处理和质量控制测试，测试通过之后进行回输。T细胞的初始分离和富集一般是从外周血单核细胞（PBMC）获得，通常可以采用Ficoll密度梯度离心法用于去除粒细胞，红细胞和血小板，最终获得T细胞。在CART制备过程中T细胞活化和扩增是必不可少的步骤。最佳激活应导致足够的T细胞扩增，而不会引起巨大的T细胞分化或激活诱导的细胞死亡。常见的是使用抗CD3/抗CD28抗体包被的磁珠作为人工抗原呈递颗粒来激活T细胞。抗CD3抗体可提供强大的增殖信号，而抗CD28抗体则可提供有效的共刺激信号。此外，T细胞通常在IL-2存在的情况下生长，IL-7和IL-15等细胞因子也被用在T细胞的培养中。在IL-2存在的情况下，离体T细胞的扩增会导致更加分化和疲惫的表型，并且会降低T细胞的持久性。与IL-2相比，IL-7/IL-15的扩增显示出增强的激活和增殖作用。扩增好的T细胞需要将相应的遗传信息转移到细胞中，CAR构建物通过病毒或非病毒载体转导入T细胞。逆转录病毒和慢病毒载体都被认为是安全有效的，它们都可以随机整合到宿主T细胞基因组中。用非病毒载体电穿孔细胞是一种成本比较低的基因转移方法，但安全性和有效性仍在评估中。一些CAR-T细胞的制造现在包括CRISPRCas9或转录激活物样效应核酸酶(TALENs)的基因编辑，它可以与腺相关病毒载体结合使用，将CAR-T细胞整合到一个特定的位点。接下来就是构建好的T细胞在离体的条件下进行扩增然，最终的细胞产物需要进行后期处理和质量控制测试，测试通过之后进行回输。3、CAR-T细胞治疗的毒副作用迄今为止，CAR-T细胞免疫疗法在白血病和淋巴瘤等血液肿瘤领域取得了重大突破，被认为是最有潜力攻克癌症的疗法之一。年FDA先后批准了全球仅有的两个CAR-T细胞疗法商业产品：诺华的Kymriah（淋巴瘤）与吉利德的Yescarta（白血病），对癌症的治疗带来了巨大的改变。虽然这种先进的生物疗法可以使某些晚期癌症患者的病情得到长期缓解，但是相较于同为免疫疗法的免疫检查点抑制剂，阻碍其发展的最大绊脚石就是毒副作用。CAR-T细胞免疫疗过程中临床常见的毒性反应包括细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NT）。CAR-T细胞相关毒副反应的发生与多种因素有关，包括CAR结构、培养方式、预处理方案、细胞剂量、肿瘤类型及肿瘤负荷等。CRS和神经毒性都归因于分泌细胞因子的T细胞的快速激活和扩张。目前的理解是，CAR-T细胞分泌的细胞因子和/或配体受体相互作用激活骨髓间室的额外免疫细胞，从而释放更多的细胞因子，创造一个激活炎症的循环，称为细胞因子风暴。在病人体内自然产生的肾上腺素也被证明有助于这种自我放大的生产环。尽管神经毒性在临床上与CRS有关，但其机制似乎不同。在识别肿瘤抗原后，抗肿瘤反应激活下游嵌合抗原受体T细胞，并激活可分泌炎性细胞因子(如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF和IFNγ)的固有免疫细胞。IL-1和IL-6的释放导致巨噬细胞中自我放大的炎症激活循环。促炎细胞因子的增加可能激活了脑血管中的内皮细胞，从而导致该区域通透性增加和毛细血管渗漏(称为血管源性水肿)，表现为局灶性水肿和神经毒性。最近的一项研究提出的另一种可能的解释是，脑壁细胞也表达CD19，靶向CAR-T细胞对这些细胞的活性导致了神经毒性。在这种反应的不同阶段进行治疗干预可以减轻神经毒性和细胞因子释放综合征(CRS)。
Fig4细胞因子风暴和神经毒性的分子认识和治疗干预
识别肿瘤抗原后，嵌合抗原受体(CAR)T细胞下游激活的抗肿瘤反应由于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素等炎性细胞因子的分泌而导致先天免疫细胞的激活-γ（干扰素γ）。这导致巨噬细胞中的自我放大炎症激活环导致白细胞介素-1(IL-1)和IL-6的释放。在该反应的不同阶段进行治疗干预可以减轻神经毒性和细胞因子释放综合征(CRS)。针对GM-CSF（lenzilumab）、IL-6受体（tocilizumab）和IL-1受体（anakinra）的治疗已在临床上用于此目的。酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼影响T细胞信号传导以降低CRS，而甲酪氨酸抑制巨噬细胞炎症激活以达到类似的效果。
常见的干预措施有：干预细胞因子，抗体阻断IL-1、IL-6和GM-CSF，阻断过度炎症反应；控制T细胞的过度激活，采用酪氨酸激酶抑制剂，阻断激活信号传导；化学药物阻断细胞因子的过度释放，采用甲胺酸阻断儿茶酚胺样作用。除毒副作用外，CAR-T治疗过程中也会产生抗性的问题，那针对抗性要怎么解决呢，我们一起往下看。4、CAR-T的耐性和抗性问题CD19突变的选择性压力是抗原丢失最常见的机制，尽管CD19的突变是最常见的，但并不是抗原丢失的唯一记录机制。有进一步的研究表明，肿瘤细胞来自一个白血病B细胞，该细胞在制造过程中被CAR转导。CAR分子掩盖了细胞表面的CD19，阻止了它被CAR-T细胞识别。这个发生的概率虽然很小，但也严重影响生产安全。除了CD19的完全丢失，Hamieh等人报道了抗原丢失的第三种机制，这解释了低抗原肿瘤逃逸是如何发生的。通过一种叫做吞噬作用的过程，CARs从肿瘤细胞中移除目标抗原并将其内在化，导致肿瘤细胞上的抗原密度降低。根据机制的不同可分为抗原依赖性和非抗原依赖性两方面。对不同原因导致的抗性，文中也提到了不同的解决措施。（1）抗原依赖性导致原因：靶抗原丢失（指CAR分子能够从肿瘤细胞上移除目标抗原，并将其内化，降低肿瘤细胞上的抗原密度）；靶抗原的基因突变导致靶标不能被有效识别；靶抗原表位被遮蔽。针对这些情况目前也找到了对应的解决措施：设计多靶向的CAR分子；增加靶抗原的表达；提高scFv与靶抗原的亲和力，可能有助于CAR-T细胞识别低密度的靶抗原。（2）非抗原依赖性导致原因：T细胞表面死亡受体缺失，造成T细胞过度耗竭；肿瘤细胞表面配体分子缺失，如FAS相关死亡蛋白（FADD）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体-2（TRAIL-2）的缺失使肿瘤细胞在体外和体内对CART细胞更具抵抗作用。针对非抗原依赖性解决措施：阻断免疫抑制检查点，阻止T细胞耗竭，可修饰CAR-T细胞上的PD-1分子，在细胞表面表达PD-1的显性负性受体或采用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除T细胞上PD-1的基因；提高CAR-T细胞的增殖能力、持久性和抗瘤活性，可在CAR-T细胞上表达IL-7受体；改变T细胞终末状态的分化，研究表明过表达c-JunAP1转录因子可以降低T细胞耗竭。在CAR-T细胞治疗领域的大多数经验是在血液系统恶性肿瘤的环境中，肿瘤微环境(TME)被认为在反应中发挥的作用微乎其微。然而，随着该领域从靶向cd19的CAR-T细胞转向实体肿瘤，抑制TME也可能产生对CAR-T细胞治疗的耐药性。这对于难以穿透、高度免疫抑制的实体恶性肿瘤，如胶质母细胞瘤或胰腺癌等来说值得倍加
