每年的5-7月是手足口病的高发期，5岁以下儿童多见，而重症手足口病大多数年龄小于3岁。每年的这时候，各家的消毒产品都会蜂拥而上。而这些消毒剂是否真的能够灭活手足口病毒，只有经过了正规机构的病毒灭活试验，才能信任。那么病毒灭活试验测试要经过哪些流程呢？一起来看看正规机构中科检测的病毒灭活试验测试流程吧。
病毒灭活试验测试：仪器设备
低温冰箱(-20℃、-80℃)、生物安全柜（Ⅱ级)、液氮罐、倒置显微镜、离心机、二氧化碳培养箱、恒温器、数字可调移液器、T25细胞培养瓶与96孔培养板、生物安全二级(BSL-2）实验室。
病毒灭活试验测试：病毒悬液的制备
细胞传代：
1）准备：生物安全柜、实验用品（试管架、洗耳球等用紫外线照射30nir~60mir。
2）润洗：从培养箱中取出要传代的细胞培养瓶，在生物安全柜内无菌操作开盖，吸弃瓶内旧培养液，加入约3mLPBS，轻轻吹打，润洗细胞，然后将洗液完全吸弃。
3）消化：加入1mL~1.5：nL含0.25%胰蛋白酶的细胞消化液。平放培养瓶，轻轻摇匀。置于37℃的二氧化碳细胞培养箱中消化2min左右，置于显微镜下观察，如果细胞圆缩、细胞间隙加大、有成片或数个细胞脱落时，应立即加入等体积的细胞完全培养基，摇匀，终止消化。
4）离心：把细胞悬液吸入离心管中，r/min离心5min~7min。吸弃上清液，加1mL~2mL细胞完全培养基，重悬细胞。
5）接种：待细胞分散均匀后，吸取适量细胞悬液于新的细胞培养瓶中并补充细胞完全培养基至10mL。将细胞培养瓶置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱中培养。
6）观察：每天观察细胞生长情况，当细胞单层布满培养皿时，即可用于试验。
细胞冻存与复苏：
1）冻存：实验前准备工作完成后，取出要冻存的细胞，选用的是生长状态良好、处于生长对数期的细胞。弃去旧培养基，加入2mLPBS，充分润洗后吸弃，加入消化液消化，方法同5.1.1.3。离心后吸弃上清液，加入细胞冻存液2.5mL~3mL，反复吹打至细胞成悬液，分装于冻存管中。标记细胞名称和代次、冻存时间、操作者名字等，放入冻存盒中，先在4℃冰箱中放置4h，再转入-20℃冰箱中4h，再置入-80℃冰箱中6h~12h。第2d移入液氮罐中，保存备用。
2）复苏：从液氮罐中取出要复苏细胞的冻存管，置于37℃水浴迅速摇晃至融化。待完全融化后，离心，弃去上清。加入细胞完全培养基，吹打均匀使细胞重悬，吸入适量到新的细胞培养瓶中并补充细胞完全培养基至10mL，使培养瓶中的细胞均匀分布，标记好细胞种类、日期等详细信息。将细胞培养瓶放置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱中培养。每日观察细胞生长情况。
病毒灭活试验测试：病毒悬液制备步骤
1）将手足口病病毒悬液适当稀释后接种于Vero细胞中。
2）加入适量细胞维持培养基，置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱中培养，每日观察CPE，通常3d~5d。
3）当发现细胞从培养瓶底开始大团脱落、75%的细胞出现CPE时，立即对细胞冻融三次(-20℃和37℃交替进行)，吸取病毒悬液于离心管中，r/min离心10min去除沉淀。
4）离心后取上清液，装入冻存管中，于-80℃冰箱中保存。
病毒灭活试验测试：终点稀释法病毒感染滴度计算
1）以半数细胞感染剂量（TCID50）表示，TCID50按式(1）计算。
TCID50对数值=病变率高于50%组稀释度的对数值＋距离比例……(1)式中：
“病变率高于50%组”是指病变率超过50%的最低组，下简称“高于50%组”。
2）计算方法如下：
计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变(一)”和“细胞病变(+)”的累积总计值。计算“细胞病变(一)”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+)”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积。各稀释度样本组“细胞病变(+)”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变(一)”与“细胞病变（+)”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率(%)。
计算距离比例。距离比可按式(2)计算：
距离比例=（高于50%组的病变率-50）/（高于50%组的病变率-低于50%组的病变率）……(2)式中：
“病变率低于50%组”是指病变率低于50%的最高组，下简称“低于50%组”。
病毒灭活试验测试：中和剂鉴定试验
1）用标准硬水配制消毒液至所需浓度的1.25倍。
2）中和剂可用PBS为基础，加入对应的中和成分，灭菌后备用。
3）试验用病毒悬液，取5.2方法制备后病毒悬液，加入等量的有机干扰物质（根据产品说明的使用条件选择30g/L或3g/LBSA)，充分混匀后备用。
4）中和剂鉴定试验用药浓度应为正式试验浓度的最高浓度，作用时间最短不少于30s。
5）中和剂鉴定试验分组。
6）每日观察CPE情况，共5d，测定各组病毒悬液的TCID50对数值。
7）中和剂的合格判断标准，可参照《消毒技术规范》(年版)。
l第1组无试验病毒，或仅有少量生长。6.2.7.2第2组有远较第1组为多，但明显较3组~5组为少的试验病毒生长。
l第3、4、5(组）试验病毒生长量相近。
l连续3次试验取得合格评价。
病毒灭活试验测试：悬液定量病毒灭活试验
1）用标准硬水配制消毒液，浓度为产品说明书推荐的最高稀释度的1.25倍，作用时间为产品说明书推荐的最短时间(t)，同时还应包含0.5t、1.5t时间，共3个作用时间。
2）中和剂：用PBS为基础，加入对应的中和成分，灭菌后备用。
3）试验用病毒悬液，取5.2方法制备后病毒悬液，加入等量的有机干扰物质（根据产品说明书的使用条件选择30g/L或3g/L），充分混匀后，于20℃℃土1℃恒温器上恒温，备用。4）试验组：将待测消毒剂溶液0.8mL加入一无菌1.5mLEP管中，于20℃土1℃恒温器上恒温5min后，加入0.2mL试验用病毒悬液，立即混匀并计时。作用至规定时间，立即取0.1mL，加入含0.9mL中和剂溶液的试管中，中和作用10min，再用细胞维持培养基作适宜稀释，取适量滴度样液0.1mL接种96孔细胞培养板（各孔中已有长满单层的宿主细胞)，每个稀释度接种4孔。
5）阳性（病毒）对照组：用标准硬水代替消毒剂溶液，其他同试验组，再用细胞维持培养基作适宜稀释，取样液0.1mL接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔。
6）观察：将细胞培养板置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，每天在显微镜下观察细胞病变，连续观察5d，逐孔观察并记录CPE情况，计算病毒TCID50对数值。
7）重复试验3次。
8）平均灭活对数值按式(3）计算
平均灭活对数值=LogNo—LogNx…..........….(3)式中：
No——阳性对照组平均病毒灭活滴度（TCID50)
Nx——试验组平均病毒灭活滴度（TCID50)
计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。
病毒灭活试验测试：消毒效果评价
按产品使用说明书指定的使用浓度（强度）和作用时间，试验重复3次。各次试验的灭活对数值均≥4.00，可判定该产品对手足口病病毒灭活效果达到消毒合格要求；阳性对照组病毒滴度对数值应不低于6.00。
病毒灭活试验测试：注意事项
1）操作人员应具备基本的病毒学和细胞培养试验经验，应使用微量移液器与一次性无菌吸头，严格按照二级生物安全实验室的要求开展试验。
2）在病毒灭活试验中，每次试验均应设置阳性对照和阴性对照。
3）使用病毒载体进行试验，可参照《消毒技术规范》(年版)的原则进行适当修改使用。
