细胞冻存是细胞培养中常见而又非常重要的工作。就像农民种地留种子一样，我们需要把状态最好的细胞留存下来，以保证将来有源源不断的种子用于培养。比如说，可以在我们相对年轻或者说在免疫力比较好的时候，把好的免疫细胞、好的种子储存起来，等以后我们患病、衰老、或免疫力比较低的时候，就可以把这些年轻的健康的种子拿出来。
何为“最好细胞”？活力四射、长相端正的细胞即为状态最好的细胞（图1）。我们可以通过显微镜观察细胞并计数来判断细胞状态，以便在合适的时机进行冻存。
图1A人非小细胞肺癌细胞
（左图密度较低不适合冻存，右图细胞形态和密度各方面都很好，适合冻存）
细胞也要防冻伤
冻存细胞，不能“一放了之”。
水在低于零度的条件下会结冰。将细胞悬浮在溶液中，随着温度降低，细胞外部的水分会首先结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡；未结冰的溶液中电解质浓度升高，如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，因此复温时大量水分会进入细胞内，造成细胞死亡。
如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。如图2所示，左图没有冻存保护剂，细胞内冰晶较多，右图有冻存保护剂细胞冰晶明显较少，原因是冷冻保护剂易与溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过改变未结冰溶液中电解质的浓度降低其渗透压摩尔浓度，使细胞免受溶质损伤。年smithAU第一次成功利用甘油冻存了红细胞，发现了冻存保护剂是影响冻存效果的一个关键因素。
图2有无冻存保护剂时细胞冻存后冰晶产生情况
速降有风险
冷冻速率的控制也很重要。冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化：
当细胞被冷至-5℃时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰。
当被冷至-5~-15℃之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。当降温速率太慢时，胞内冰晶的形成风险较低，同时说明细胞脱水最大化；当降温速度较快，胞内脱水，胞内溶质的含量和细胞收缩都不太严重，且细胞暴露在非生理环境的时间更短；当降温速率太快，没有充分脱水，就不能阻止胞内冰核的形成。
可见，太快和太慢都不是我们所希望的，而更需要着重优化的是“较快”这种情况。我们需要根据冻存规模选择不同的冻存方式和设备，以便将降温速度控制在每分钟下降1~3℃。
冻存方法的演变
图3传统的棉花包裹冻存
在早期实验环境相对简陋的条件下，我们会将细胞包裹至大团棉花或纱布中放入4℃冰箱，然后半小时左右后放入-20℃冰箱，再两小时左右放入-80℃冰箱过夜，但是这种方式无法稳定地控制实际的降温速率，目前已逐步被市场淘汰。
图4程序降温盒冻存
如今，商业化的程序降温盒解决了降温速率的控制问题，可以做到每分钟约1℃的缓慢降温速率。程序降温盒是通过在夹层内装入%异丙醇来进行控温的。我们可以将细胞冻存管放入冻存盒内部，然后直接放入-80℃冰箱。这个办法简单易操作，不过冻存规模较小，无法适应大规模生产的需求。
图5程序降温仪冻存
对于将要上市进行生产的细胞株或者一些比较脆弱的细胞，它们需要更加精确的降温速率来实现细胞在不同降温区间所需的降温速度。很多商业化的细胞程序降温设备都能实现这一操作，可人工设计并编辑降温区间、降温时间、降温速率，因此能更好地满足药物生产和生物学研究所需。
我们会针对目标细胞株设计一系列的筛选实验，在常规保护剂的基础上还可根据细胞类型添加海藻糖、白蛋白等，同时对降温程序进行优化，通过调整降温速率、时间、区间来平衡样本温度和腔体温度之间的差异，以获得平滑且适合该细胞的温度曲线。这种方式做到了对降温全过程的温度控制，可以针对不同种类的细胞开发差异化的细胞冻存工艺，同时实现大规模细胞冻存的目标。
图6程序降温仪的降温曲线
（上方曲线为样品温度曲线，下方曲线为腔体温度曲线）
从“冻”到“存”
前面说的都是怎样更好地冻细胞，那么冻完的细胞如何怎样长期保存呢？
最关键的是冷冻保存温度。冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果，冷冻保存温度可以不同，但从实际和效益的观点出发，液态氮的低温环境(-℃)是目前最佳的冷冻保存温度。在-℃时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能却完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-℃下可保存十年以上。应用-70℃~-80℃保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。
总的来说，细胞冻存是保障细胞培养的持续稳定进展的重要组成部分。标准化的大规模细胞冻存平台技术的发展，对建立质量优异且均一稳定的生产用细胞库更是重中之重。
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作者简介
唐浩江苏太平洋美诺克生物药业有限公司副总经理，负责药品研发、质量控制、质量保证、药品注册等工作。主要从事抗体药物的研发及生产，尤其是抗体药物的分离纯化工艺、制剂工艺、质量体系等方面的研究。
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