通常认为，T细胞生命周期的延长是通过激活T细胞中的端粒酶实现的。在这篇文章中，作者发现除了依靠端粒酶的作用，某些T细胞还可以通过另一种方式延长端粒，即摄取抗原递呈细胞（antigen-presentingcells,APCs）提供的携带端粒的细胞外囊泡（extracellularvesicles,EVs）。
T细胞获得来自APCs的端粒后，在多种细胞因子的作用下，将其“组装”到自身染色体末端，通过这种方式可将端粒延长约bp，从而延缓细胞衰老，提供长期免疫保护。
研究背景
端粒位于染色体末端，由TTAGGG重复序列组成，其作用是保护染色体。端粒会随着细胞的分裂越来越短，端粒缩短与细胞衰老密切相关。在免疫反应中，APCs向淋巴细胞递呈抗原，刺激产生记忆T细胞的同时，也会导致端粒酶的激活，以延缓端粒的损耗。但端粒酶的作用不足以让T细胞长期逃避衰老，本文作者发现，部分T细胞可以获取来自APCs的端粒，成为干细胞样记忆T细胞或中枢记忆T细胞（stem-likeorcentrallong-livedmemorycells），从而长期避免衰老，而其他未能获得来自APCs端粒的T细胞则较快进入衰老程序。
研究内容
端粒转移
作者通过观察端粒限制性片段（telomererestrictionfragment,TRF）研究T细胞与APCs之间的相互作用，结果显示当抗原存在时，免疫突触形成后T细胞端粒延长而APCs端粒缩短。在敲除端粒酶基因的T细胞中，同样能观察到上述现象，这说明端粒的延长不依懒于端粒酶。此外，作者还证明了端粒的延长与DNA的断裂重组无关。由此，作者推测T细胞延长的端粒可能由APCs提供。
突触形成前后APCs和T细胞的TRF分析
通过荧光原位杂交技术，可以观察到APCs中的端粒被递送到T细胞。
T细胞与APCs免疫偶联中端粒聚集
用BrdU标记的APCs进行实验，发现APCs在与T细胞接触时会释放端粒。同时，作者通过对比实验，排除了APCs或T细胞单独存在时自发释放端粒的可能。
斑点印迹（dotblot）验证端粒的释放
用离子霉素（ionomycin）代替T细胞与APCs接触，同样可刺激APCs产生包含端粒的EVs。
qPCR验证EVs中的端粒
标记APCs细胞膜和DNA，用离子霉素刺激APCs释放包含端粒的EVs并进行观察。结果显示，两种标记共定位于包含端粒的EV。免疫金标记端粒，在透射电子显微镜下可检测到标记的DNA，类似结果在场发射扫描电子显微镜下也可观察到。
透射电子显微镜下观察到的包含端粒的EV场发射扫描电子显微镜观察结果
为验证APCs释放的端粒是否被T细胞利用，作者用EdU（5-ethynyl-2′-deoxyuridine）标记APCs的DNA，分离纯化EdU+的EVs，加入T细胞培养基中，48h后进行观察。结果显示，T细胞染色体末端出现EdU+DNA片段。
荧光原位杂交验证EdU标记的端粒转移到T
端粒释放机制
为研究哪些成分是APCs释放端粒必须的，作者构建人工磷脂双分子层结构（含TCR和诱导MHC识别的抗原）进行实验（2a），结果显示，端粒标记的APCs可被激活并释放端粒（2b,2c），由此推测APCs与T细胞之间的抗原特异性接触可能是触发端粒转移的条件。用酪氨酸蛋白激酶抑制剂提前处理APCs，可阻断端粒释放（2c）。端粒探针、脂类染料、明场照明、同型对照验证了端粒的释放（2d,2e,2f）。
将包含端粒的EVs转移到T细胞，在MHC-II阻断抗体存在的情况下，也可以观察到T细胞端粒的延长（2g）。由此推论，在端粒释放后的转移过程中，MHC信号不是必须的。
图2，TCR参与APCs释放含端粒的EVs
进一步评估含端粒EVs的组成，免疫印迹和酶联免疫吸附试验（ELISA）显示，含端粒的EVs富含囊泡和组织相容抗原蛋白及端粒锌指相关蛋白（TZAP）（3a,3b）。TZAP可调控端粒长度，开启并触发端粒修剪（telomeretrimming），设定端粒长度上限，维护基因稳定。离子霉素诱导的APCs激活使TZAP的表达量增加，TZAP的端粒修剪活性增强（3c,3d），在TZAP缺陷的APCs中（3e），端粒释放减少（3f,3g），过表达TZAP后可在免疫突触检测到TZAP。由以上结果推测，TZAP是端粒转移的必要条件，它参与端粒修剪及转移。
图3，TZAP参与端粒转移
APCs激活后（离子霉素激活或T细胞激活），POT1（端粒结合蛋白）、TRF2（端粒重复结合因子2）表达下调（4a,4b,4c）。共聚焦成像显示，端粒和其结合蛋白的共定位不是绝对的，APCs中的端粒有些可能天然缺乏保护（4a）。后续实验中，作者测试了端粒结合蛋白的缺失是否会导致APCs释放端粒，免疫荧光分析表明，含端粒的EVs中不含TRF2或POT1（4d），增强APCs中TRF2/POT1的表达，可抑制APCs释放端粒（4e），破坏细胞中的端粒结合蛋白可诱导自发的端粒释放（即使APCs未激活）。荧光标记流式细胞分选（fluorescence-activatedvesiclesorting）量化TRF2/POT1对APCs释放端粒的影响（4g,4h）。由此，可认为TRF2/POT1可阻止端粒转移，一旦这些蛋白被降解，TZAP可诱导端粒修剪并通过EVs释放。
图4，APCs可释放端粒
免疫荧光发现，端粒EVs中保留了Rad51（DNA损伤修复蛋白，参与端粒延长），（5a），免疫印迹分析进一步证实了更多Rad51类似分子的存在（5b）。
作者推测，Rad51是囊泡转移必需的，为验证这一推论，构建Rad51缺陷的APCs（5c），其产生的端粒EVs数量（5d）、大小（5e）、关键分子（5f）都保持正常，但BRCA2（参与端粒稳定性的维持）减少（5f）并出现单链端粒DNA（5g），显示端粒重组潜力受损。
为研究Rad51缺陷对端粒转移的影响，用荧光探针标记Rad51缺陷APCs的端粒DNA，离子霉素激活APCs，收集含荧光的端粒EVs并转移到单独培养的T细胞中，24小时后进行观察。结果显示来自Rad51缺陷APCs的端粒与单独培养的T细胞端粒未能共定位（5h），且T细胞端粒的长度增加更少（5i），这种差异不是由于Rad51缺陷APCs释放的端粒本身长度更短（5j）导致的。qPCR证实，与正常对照相比，Rad51缺陷APCs释放的端粒EVs不能有效延长T细胞端粒（5k），Rad51对端粒转移到T细胞后延长T细胞端粒是必须的。
图5，Rad51缺陷影响T细胞端粒延长
端粒转移让T细胞免疫效应持续时间延长
体外培养的T细胞往往加速衰老，实验发现，当加了含端粒的EVs，T细胞的增殖增强约3倍（6a）。为测试端粒转移是否可以保护T细胞免于衰老，对各组T细胞的衰老标志物（β-半乳糖苷酶、sestrin）进行检测，摄取正常APCs端粒EVs的T细胞衰老标志物明显更少（6b）。此外，实验发现含端粒的EVs可阻止幼稚状态T细胞向衰老状态T细胞转变（6c），同时，干细胞样记忆T细胞和中枢记忆T细胞增加（6d）。
接下来，作者研究了体内的端粒转移过程。OT-II卵清蛋白（OVA）抗原特异性系统被用来进行研究，受体动物足垫注射负载OVA的APCs，18h后静脉注射CTV标记的OT-IIT细胞（可特异性识别OVA），18h后收集淋巴结（6e）。结果显示，约50%OT-IIT细胞从负载OVA的APCs获得了端粒（6f）。此外，我们也证实了在体内，APCs释放的端粒转移进入T细胞（6g）。
在后续实验中，作者用CD45.1/2进行T细胞追踪研究。CD45.1小鼠注射CD45.2OT-IICD4+T细胞，这些细胞从负载OVA的APCs（TelC标记）获得了端粒（对照组为未获得端粒的相同细胞），18h后注射抗原，5天后进行观察，结果显示，从APCs获得端粒的T细胞与对照组相比细胞增殖更多（6h），表明端粒转移促进了T细胞的增殖。用同样的实验观察T细胞寿命，结果显示小鼠脾脏和淋巴结中，带有APCs端粒的T细胞比例增加（6i）。同时，干细胞样记忆T细胞和中枢记忆T细胞也出现增加（6j）。以上结果表明，T细胞接收APCs端粒后可能会迅速迁移到长期储存库，以维持长期的免疫记忆。
图6，端粒转移使T细胞保护作用延长
在进一步的实验中，作者对Rad51的作用进行了体内研究。CD45.2OT-IICD4+T细胞分别接收含有Rad51和不含Rad51的端粒EVs（离子霉素刺激产生并纯化），之后注射CD45.1小鼠，并进行后续抗原注射（7a）。观察T细胞在脾脏及淋巴结中的比例，接收含Rad51端粒EVs的CD45.2OT-IICD4+T比例增加，不含Rad51的对照组则没有增加（7b,7c）。类似的，T细胞表型调节也需要Rad51存在（7d）。
图7，端粒转移延长T细胞寿命需Rad51参
最后，作者测试了端粒EVs在免疫防御中的作用。FLUAD免疫的T细胞用APCs端粒EVs处理（或端粒缺失EVs处理），然后注射到未接种疫苗的小鼠体内，受体小鼠间隔不同时间后感染H1N1流感病毒，以评估长期免疫保护作用（8a）。结果显示，未注射T细胞的小鼠感染H1N1后迅速死亡，另外两组短期保护作用相似（8b），然而，长期保护作用则需要FLUAD免疫的T细胞接收正常的APCs端粒EVs（8c），这表明端粒的转移可以增强免疫细胞的长期记忆。
图8，免疫防御中端粒EVs的作用
结论
作者认为，端粒转移可能是T细胞是否衰老的一个信号，APCs通过转移端粒到部分T细胞，使其免于衰老，成为长期存活的记忆细胞。
利用这种机制，或许可以开发出新的治疗方式，以延长免疫系统的寿命，对抗某些年龄相关的疾病。
LannaA,VazB,DAmbraC,ValvoS,VuottoC,ChiurchiùV,DevineO,SanchezM,BorsellinoG,AkbarAN,DeBardiM,GilroyDW,DustinML,BlumerB,KarinM.AnintercellulartransferoftelomeresrescuesTcellsfromsenescenceandpromoteslong-termimmunologicalmemory.NatCellBiol.Sep15.doi:10./s---z.
