荧光显微镜是目前生物、医疗等领域的基础仪器，和一般的光学显微镜相比，它的原理和参数指标有所不同，今天我们就来带大家了解下，荧光显微镜的原理及其应用、应用难点。
一、荧光显微镜原理
在荧光显微镜中，荧光指的是一种光致发光现象：某些分子能吸收特定波长的光线（激发光），然后再发射出其他波长的光线（发射光）的物理现象。这种分子称为荧光团，荧光团的激发光谱和发射光谱之间存在差值，发射光能量比发射光低，波长比激发光长，这个差值称为“斯托克斯位移”。
荧光现象有两种：自发荧光与继发荧光。自发荧光是指样品自带荧光团，经照射后就能发出荧光，如叶绿体；继发荧光也称二次荧光，样品经照射后不能发出荧光，需先用荧光染料标记处理，再经照射才能发生荧光。荧光显微镜主要利用的是继发荧光。
MF52-N观察念珠藻（叶绿体荧光）
荧光成像包含激发和发射两个过程，在荧光显微镜中体现为以下几个关键部件：
（1）激发光源：提供激发光，有两个主要指标
光谱覆盖：需要较宽光谱，以覆盖发射光谱。不同荧光团需要不同波长的激发光，因此激发光源需要较宽的光谱，以覆盖各种波长激发光的需要。如果应用场景限定为真菌检查等，也可能采用窄光谱的单通道激发光源，但这种显微镜无法满足研究等应用需要。
MF31荧光显微镜拍摄的真菌
发射光强度：光源在不同波段的光强不同，理想状态下发射光高强的波段要匹配荧光染料的激发峰值，较高亮度的激发光可产生较强的荧光发射。
宽光谱、高光强的LED荧光光源MG-
现在主要用宽光谱、高光强的LED荧光光源，如MG-
（2）激发块：形成特异性激发/发射的滤光片组，在落设荧光显微镜中由三个部件组成
激发滤光片EX：只让特定波长激发光通过，用以激发特定荧光染料
发射滤光片EM：匹配荧光染料特性，只让特定波长的发射荧光通过
二向分色镜DM：反射激发波段的光，透过发射波段的光。这是目前主流的落射荧光显微镜都有的部件，透射荧光显微镜没有这个滤光片。
激发块以往向原厂购买，成本高
二、荧光显微镜的应用
荧光显微镜广泛用于生物、医疗、矿物、材料科学等领域。
1、在生物学领域，荧光显微镜借助荧光染料标记，可准确而详细地识别细胞和亚微观细胞成分和活动。
2、在医疗领域，荧光显微镜可借助荧光试剂，来检测细菌、病毒的存在和分布，或对外科目标进行辅助标记方便手术进行。
荧光显微镜MF31观察SBS改性沥青
3、在矿物学领域，荧光显微镜常用于研究有自发荧光特性的物质，如沥青、石油、煤炭、氧化石墨烯等矿物。
荧光显微镜MF52-N观察磁珠
4、在材料科学，荧光显微镜可用于纺织工业或造纸业来分析基于纤维的材料，包括纺织品和纸张
5、在半导体领域，荧光显微镜也可用来观测具有荧光特性的材料如磁珠等。
荧光显微技术在生物学和医疗领域中应用是最广泛也是最复杂的，样品和目标从肉眼可见的模式生物如斑马鱼，到光学显微镜无法看清外形的细菌病毒，都会涉及。针对不同样品和目标，需要考虑不同的荧光标记策略，一是荧光染料能标记的目标，二是荧光染料对应的激发特征，包括吸收光谱特征和发射光谱特征。借助荧光染料，荧光显微镜能针对的目标不只局限于蛋白质，还可以包含核酸、聚糖，甚至钙离子等非生物物质。
以下根据染料结合的位置列举了一些常见的荧光染料及应用范围：
MF52-N观察FITC荧光染色蛋白
（1）蛋白染色：免疫荧光（IF）是蛋白质标记的主要方法。免疫荧光技术利用抗体可以和相应抗原特异性结合的特性来染色，主要有两种方式：一是利用内源荧光信号，即通过克隆技术用遗传学方法将荧光蛋白与目标蛋白相连，如GFP等；二是利用荧光标记的抗体与目的蛋白特异性结合。
FITC（异硫氰酸荧光素）：是一种有机荧光染料，/nm为该染料激发/发射峰值，可以和蛋白质上的基团结合，主要用于免疫荧光和流式细胞术中。
TRITC（四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸）：属于罗丹明家族的衍生物，/nm为该染料激发/发射峰值，可与蛋白质结合。
花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特异性吸附少，消光系数高，荧光量子产率高，从而让标记显影时背景弱，信号强。除细胞显影外，它们也常用于生物筛选、蛋白免疫印迹、生物医学显影、小动物体内成像等。
AlexaFluor系列：属于带负电荷且亲水的荧光染料系列，是不同基础荧光物质的磺化形式。这些产品标识涵盖了对应的激发波长，相比于FITC等染料，具有更好的稳定性和荧光亮度。
MF52-N观察DAPI荧光染色细胞核
（2）DNA染色：主要标记核酸。同蛋白质一样，对核酸进行标记与研究同样有重要意义，如对细胞核（主要成分为核酸）进行染色标记可以判断细胞的数量和位置，值得提醒的是，DNA染色染料通常具有毒性，需要小心操作，染色后尽快完成观察。
DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）：当DAPI与双股DNA结合时，在nm处有一个最大吸收峰，在nm处有一个最大发射峰，其发射光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可与RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果。DAPI可以透过完整的细胞膜，因此被广泛用于活细胞和固定细胞的染色。
Hoechst（、、）：这三种染料都可在nm左右的紫外光激发，在nm处发出蓝靛色荧光。与DAPI类似，Hoechst可透过完整细胞膜，被广泛用于活细胞和固定细胞染色。
PI（碘化丙啶）：是一种不能透过细胞膜的DNA染色剂。与核酸结合后，最大激发波长为nm，最大发射波长为nm。由于该染色剂无法进入完整的细胞中，因此该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。
Fura2钙离子探针做的研究图片
Fura2钙离子探针做的研究图片引自公开文献Front.NeuralCircuits11:11.doi:10./fncir..
（3）离子染色：研究细胞中各种离子的流动与分布对细胞活动的深入理解有重要作用。通过各种离子指示剂，如钙离子、钠离子、镁离子、锌离子等指示剂与离子结合形成荧光团，利用光谱特征检测对应离子的分布状态。
三、荧光显微镜应用中的挑战和解决
荧光显微镜的应用和成像，不仅要考虑成像的质量，包括分辨率、对比度、荧光信号强弱、背景光、多通道成像等，还要考虑荧光染料、光照等对样本的影响，比如荧光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了荧光显微镜应用中的常见挑战与应对方法：
汞灯需搭配带计时器的复杂控制箱来使用
（1）激发光源选择和使用存在难点。传统荧光成像使用的是高压汞灯，具有特异性的光谱特征和较高的光强，但使用有很多麻烦，首先需要预热，然后光强靠ND滤镜调节，最后寿命较短可能就小时，在寿命用完前还会有光强衰减问题，需要调整ND滤镜，寿命用完替换新灯泡后还需要重新校中。目前很多应用都用LED荧光光源取代汞灯作为荧光光源，如宽光谱大功率LED荧光光源MG-，寿命长单个可以顶50个汞灯，光强更稳定可控，并且可以即开即用，省事省心。
滤光片组可谓荧光显微镜核心参数
（2）滤光片质量和匹配度需要挑选和定制。荧光显微镜的滤光片质量决定激发光和发射光的透过率，影响荧光效率并带来杂散光和背景噪声问题。同时，滤光片的参数能否匹配荧光染料的激发峰和发射峰，也会对荧光效果产生重大影响。对于简易荧光需求，建议使用数显LED荧光模块，整合光源和BGU等常用激发块，可以为四大品牌无限远显微镜升级荧光观察，简单易用效果好。对于专业荧光显微镜，一般建议用官方荧光模块（荧光臂），然后后配Mshot等品牌的激发盒和滤光片组，Mshot可更低成本按需定制不同滤光片组合，如钙离子Fura2探针需要用U激发G发射，一般的U激发B发射滤光片组并不适合。
研究级荧光显微镜MF43-N观察小鼠脑片荧光
（3）光毒性与荧光染料毒性需要控制。在生物学领域的荧光成像中，需考虑光毒性与荧光染料毒性对样本的影响，如细胞内的有机分子在与氧反应时吸收光发生分解并产生自由基，部分荧光染料本身也能产生自由基，这是引起细胞等生物样本损伤的主要来源。通常的应对思路是：①使用长波长激发、低能量的荧光染料，如CY7；②尽可能低的光强和尽可能短的激发时间，尽可能降低高光强和长实践照射对样品影响；③使用高灵敏度相机，和低光强、短时间对应，需要高灵敏度相机来保证在弱荧光信号下的成像。
MF52-N软件合成多色荧光图像
（4）多色荧光成像需要规划，避免激发光谱重叠。在对活细胞标记成像时，往往需同时对多种物质进行标记，并在一个图像中显示，在开始前需要先按激发和发射波长选定荧光染料来标记不同目标，避免多个目标的激发光谱出现重叠，变得无法分辨。在荧光显微镜层面，可以用窄带发射滤光片而非长通发射滤光片，来减少激发光谱重叠问题；或者使用双通滤光片，搭配成熟的双通道荧光染色方案，实现两种荧光标记目标的同时观察，这在FISH荧光原位杂交中比较常见。
荧光显微镜搭配双通滤光片拍摄的细胞
（5）多色荧光成像，光强需要按不同通道成像效果调整，或使用亮度记忆功能分别设置。在多色荧光成像中，还需注意观察显微镜相机实时成像，调整对焦和激发光强。因为不同激发波段的对焦点会稍微有不同，而且不同通道的荧光染料效率不一致，不调整就会出现部分成像模糊、过曝，会导致合成图像发白、亮度不平衡，这一点对于U通道激发的DAPI等更明显。解决方法有两种思路，一是按成像效果每拍一张就调整一次亮度，从而避免出现过曝，这是传统思路，比较折腾；另一种思路是让光源独立记忆每个激发通道的光强，从而方便地调整到各通道均衡的状态，传统汞灯智能走第一种思路，更先进的Mshot的数显LED荧光模块和四通道LED荧光光源MG-都采用了后者思路。
如果您觉得这篇文章有帮助，欢迎点赞收藏转发，如果您对荧光显微镜的原理和应用还有什么疑问，欢迎留言或私信咨询，如果您有荧光成像需要但不知道如何制定方案，我们也非常乐意为您解答。
