大家好！我是国科东方绿豪克，我是生命科学方向的博士。
上一期我们着重介绍了玉米花药的取材，下面我们来解读一下后面的结果。得到两次技术重复的结果后要进行分析，首要的问题是解决第一个科学问题，即：在前减数分裂孢子细胞分化过程中是否存在具有不同基因表达的中间细胞阶段？那么解决这个问题就需要明白生殖细胞分化早期的动态过程。
作者通过拟合发育轨迹的方法，从生物学上推断细胞所处的发育时间，从而能够发现不同发育阶段过程中基因的变化情况。
从下图A可见，通过降维来拟合时间，获得拟合发育时间曲线，并且两次的技术重复的一致性达到0.97。接着细胞按照拟发育的时间进行排序，通过计算相邻细胞的拟合发育时间变化的斜率来代表细胞间表达谱变化的强度（下图B）。图B作为图C结果的标准，那么图C显示拟发育时间速率与生物发育时间的关系。通过拟合时间速率曲线发现，在生殖细胞发育起始阶段基因有一个连续稳定的改变，有三个速率明显要高于平均值的峰（下图C）。其中这三个峰跟8个单细胞聚类群一致，这说明拟时间发育有聚类所不具备的能力，除了能进行类群的区分，还能对发育的动态过程和基因变化有一个很好的了解。
为了进一步明确拟时间发育时间变化速率与已知的发育进程的关系，作者采用了热图可视化随着时间显著变化的基因。由图D可见，热图展示所有随拟发育时间显著变化的基因。基因表达连续改变的阶段是从小于1.1mm花药到早期的花粉母细胞阶段（图CD前两个蓝色和灰色阶段），表达没有明显的改变表示孢子细胞停止有丝分裂进入花粉母细胞，这一过程是比较稳定的。减数分裂第一阶段开始于1.2mm的花药，而最后两个峰发生在减数分裂的前期，这里将Pr1定义为前期过渡表达阶段1，Pr2为前期过渡表达阶段2。
既然找到两个关键的峰（Pr1和Pr2），那么减数分裂前期这两个转录水平改变的峰是否与减数分裂过程中细胞所处的分裂阶段有关呢？我前文讲到，分裂阶段的定义从形态学上是染色体的细胞学形态，所以后期的分析就要考虑到细胞状态了。从单细胞RNA-seq数据中选取了Pr1和Pr2阶段的5个marker基因，由上图A可见，Ago18a和Rpl38e在Pr1和Pr2下调，Rmf和C3h3在在Pr1上调，Trps8在Pr2中上调。这些基因将作为Pr1和Pr2发育时期重要的marker基因。
找到marker基因之后就要搞清楚Pr1和Pr2是否与减数分裂阶段有关系呢？那么作者就比较从46个花中分离的1.1-1.6mm的花药基因表达与染色体细胞学形态的关系（上图B）。每朵花同步发育的3个花药进行比较，一个进行固定来观察细胞状态，另外两个用qPCR进行定量。通过定量分析发现，这些marker基因在定量中与单细胞的分析结果是一致的（上图B），同时与平行组中的细胞学发育进程也是一致的。Rmf和C3h3（Pr1的marker基因）在减数分裂前的间期和细线期表达低，而细线期和中央核仁阶段上调表达，之后的时期都有较高的表达。所以在细线期和中央核仁阶段开始，Pr1发生了转变。Pr2的标记基因Trps8在偶线期中上调，在偶线期之前无变化，说Pr2高表达时期，已经完全进入了偶线期。
如下图C所示，分别表示细线期早期细胞形态学与基因表达的关系，该研究充分考虑到细胞学形态以及基因表达，将两者进行结合，从而对减数分裂有更清晰的认识。下图D则清晰的展现了Pr1到Pr2阶段以及孢子细胞到花粉母细胞的表达变化超过两倍的基因占比，在前个表达基因中，大约有26.7%的基因在Pr1和Pr2发生了至少两倍的变化。
同时，作者还通过突变体分析Pr1和Pr2表达的变化是否受控于体细胞或是减数分裂过程中染色体形态的变化，也就是说在体细胞分化和或减数分裂进程中重要的基因突变，从而判断Pr1和Pr2marker基因是否有所改变。结果除了Trps8（Pr2的标记基因）存在一些延迟表达，其他的基因均为正常表达（上图E和F对比）。进一步对am1等位基因突变体进行分析，am1-praI突变可进入减数分列前期，但停滞于偶线期，而am-突变则只进行有丝分裂无减数分裂。通过这两种突变体发现，Pr1和Pr2的marker基因均能在am1-pral正常表达（上图G）。而在am1-中，2mm花药阶段，marker基因有些异常表达，但在2.5mm阶段标记基因的表达量与野生型是一致的（上图3H），此阶段的染色体形态却是异常的。综上说明，早期阶段marker基因的表达与减数分裂的染色体形态是无关的。这一过程表明Pr1和Pr2状态的转变是自发的，在正常减数分裂受阻后，依然正常的发生转变。
未完待续……
