自然杀伤细胞（naturalkillercell，NK），是固有免疫细胞中的重要成员，无需抗原预致敏就能破坏靶细胞，且无MHC限制性，应答速度快，在免疫应答的早期即可发挥作用。最近也有研究显示，NK细胞也能展现部分适应性免疫细胞的一些特性。NK细胞表面不表达多态性克隆型受体，如t细胞受体(TCR)或b细胞受体(BCR)，它们的细胞杀伤功能的激活主要是由识别靶细胞的受体调控的。从外周血中分离出的静息人NK细胞可以在添加人血清的培养基中，体外存活数天，可用于后续研究受外源刺激后，其表型的改变，及其对下游细胞增殖、杀伤等能力的影响。
图1.NK细胞在肿瘤中的“两幅面孔”
本文整理了从人外周血中分离NK细胞的方法、体外培养条件以及功能检测的相关方法：
实验前准备：
第一部分从人外周血中分离NK细胞
一、PBMC的制备：▲注意：外周血或血沉棕黄层不应超过8h。1、将15mlFicoll（Cat:）加至50ml离心管中；2、离心管倾斜30°，将35ml稀释后的血液沿着管壁轻轻铺在离心管中的Ficoll试剂上，避免液体混合；▲注意：用PBS-EDTA缓冲液讲血液体积稀释至2-4倍，血液样本越稀释，PBMC的纯度越好。3、室温20°C，Xg离心30-40min；▲注意：水平离心机，且应缓升缓降，关闭骤停设置。4、小心的从离心机中取出离心管，Ficoll分离液和血浆之间的白膜层，即为PBMC；5、吸弃上清后，将白膜层轻轻地吸出来转移到新的50ml离心管中（多个管中的白膜层可以混在一起）6、用45mlPBS重悬，室温20°C，Xg离心10min，重复操作2次，弃去上清；7、适当的缓冲液重悬，对PBMC进行细胞计数。
二、NK的分选：PBMC制备好以后，采用磁珠分选的方式以达到分离NK的目的，会要用到一些磁珠抗体以及磁力架等产品。具体操作根据自己所需的目的细胞群，购买相关的磁珠产品进行实验即可，都配有非常详尽的产品使用说明书。常见分选产品如下：
图2.NK细胞的常用分选试剂盒汇总
三、NK的流式鉴定：第一次实验操作，建议分选后的细胞，进行NK细胞的活性和纯度的鉴定，避免磁珠操作不当引起的后续实验的不良结果：常规推荐选择死活染料+CD3-CD56+（orNKP46+）的群体。
分选前分选后图3.NK细胞的纯度鉴定
第二部分NK细胞的体外培养
1、重悬0.5-3x10^6个细胞，在含有10%HS（人血清）的LIMDM培养基中（96孔板）。2、用10%HS的IMDM将人IL-15稀释至1g/mL。加入L到步骤1中，即稀释后的人IL-15最终浓度为0.5g/mL。▲注意：此处IL-15为饱和浓度。较低浓度的IL-15或与IL-15其他已知可刺激NK增殖的细胞因子联合刺激均可摸索。如IL-2、IL-15、IL-7、IL-18等单独或组合均能有效地诱导、刺激特定的NK细胞增殖和促进其分化成熟，其中IL-2和IL-15的作用尤为明显。3、将细胞置于37℃的培养箱培养至少48h(可设置用不含IL-15刺激细胞作为对照），再进行后续细胞功能鉴定等实验（表型、外源药物刺激、转染、共培养等操作）。
第三部分NK细胞的功能检测
一、表型鉴定：
图4.NK细胞在不同成熟阶段的圈门策略
二、细胞杀伤能力鉴定：
图5.表征人类NK细胞自然杀伤功能的panel
三、细胞共培养杀伤能力鉴定：1、用GFP，CFSE等带荧光的染料去标记NK的靶细胞；2、将NK细胞与靶细胞的共培养（不同的靶细胞，培养比例梯度和培养时间需要预实验摸索）；3、收样后，用CD56流式抗体标记NK细胞，结合绝对计数微球，对靶细胞的数量检测，进行统计分析
图6.细胞毒性实验
四、细胞因子分泌能力：使用Elisa单指标检测，或CBA,MSD，Luminex等多因子检测方法，检测NK细胞培基上清的细胞因子表达水平。
图7.NK分泌的细胞因子作用
参考文献：[1]ZottoGD,AntoniniF,PesceS,etal.ComprehensivePhenotypingofHumanPBNKCellsbyFlowCytometry[J].CytometryPartA,,97(9).[2]TrabaJ,WaldmannTA,AntonOM.AnalysisofHumanNaturalKillerCellMetabolism[J].JournalofVisualizedExperiments,().[3]Lal,Kerri,G,etal.OMIP-:Functionalanalysisofhumannaturalkillercells[J].CytometryPartAtheJournaloftheInternationalSocietyforAnalyticalCytology,.[4]AbelAM,ChaoY,ThakarMS,etal.NaturalKillerCells
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