在成人大脑中，从神经干细胞(NSC)静止到激活的过渡是神经再生的调节焦点，过渡中的失调会导致大脑疾病。1,2在此过渡期间，细胞周期状态和代谢（包括线粒体）进行广泛的重编程。对这种全面变化的深刻理解是全面了解生理学的先决条件，可能有助于抗击疾病。然而，协调其时空规则的机制仍然是一个鲜为人知的主题。一个关键的挑战是建立合适的实验系统并寻找在过渡期间协调细胞周期和代谢重编程的主控制器。
c-Myc是一种具有数千个靶点的多功能转录因子，在癌细胞的细胞周期和代谢协调中起着核心作用C-myc介导的代谢转换对于干细胞的命运决定也是至关重要的来自AllenBrainAtlas的RNA原位数据表明，c-Myc转录本在成年海马中表达，而成年海马正是神经发生活跃的地方。第1a及b条)。进一步的形态学和免疫染色分析显示c-Myc在干细胞和祖细胞间室中表达(图)。1a及附图。S1d).静止的神经干细胞(qNSCs)主要为c-MycLow细胞(71%±5%)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和SOX2阳性，而Ki67细胞(核)阳性。c-Mychigh细胞(28%±1%)仅为一个小亚群。1b)，可能代表静止的神经干细胞的亚群被激活。Sox2/Ki67阳性但GFAP不阳性的活化神经干细胞(aNSCs)和增殖前体细胞多为c-Mychigh细胞(67%±1%)，少数为c-MycLow细胞(2%±1%);n=)(Fig.1b).为了支持上述观点，通过对已发表的scRNA-seq数据的分析，证实了c-Myc在aNSCs中有高表达，而在qNSCs中则没有。S1c).
图。1
c-Myc通过协调细胞周期和线粒体重构调节神经干细胞的平静和活化。用GFAP(绿色)/Sox2(白色)/Ki67(绿色)和DAPI(蓝色)共染色确认神经干细胞和祖细胞c-Myc表达(红色)。qNSCs:GFAP+/Sox2+/Ki67-和aNSCs:GFAP-/Sox2+/Ki67+。Bc-Myc在神经干细胞和神经干细胞中的差异表达。qNSCs以c-Myc低细胞为主(71%±5%)(n=)，以c-Myc高细胞为主(67%±1%)(n=)。c-Myc基因在神经干细胞中的表达动态。左侧:神经干细胞和神经干细胞的c-Myc染色;右图:c-Myc染色与DAPI融合。Drt-qpcr分析显示，c-Myc基因在静止诱导后即刻(6h)发生快速抑制(n=)。静止诱导半小时后，c-Myc转录本已经减少了2倍，达到1.5倍减少了到10倍。E蛋白印迹分析显示，在静止过渡期间c-Myc蛋白水平下降。F上调()基因启动子的转录因子结合基序富集分析示意图。G逆转录-定量pcr检测神经干细胞静止诱导后顶端富集转录因子的表达动态(n=)。对于每个基因，以其在第一时间点的表达值作为其序列的正规化控制。线粒体基因在aNSCsvqNSCs中的表达模式。I线粒体基因在aNSCs(a)、c-MycKDaNSCs(KD)、qNSCs(q)和c-MycOVqNSCs(OV)中的表达模式。J透射电镜观察aNSCs和qNSCs线粒体形态和大小的变化。K线粒体在精原干细胞和精原干细胞中的分布及嵴状态对其分类的影响。过表达和击倒改变了线粒体的形态和大小。不同类型c-Myc过表达和敲除线粒体的m分布。NKi67(红色)和DAPI(蓝色)染色于aNSCs和转染载体(n=8)、c-MycOV(n=9)、scramble(n=7)和c-MycKD(n=8)的qNSCs。用Ki67染色法检测c-Myc-OVqNSCs(n=9)增殖增强，c-MycKDaNSCs(n=8)增殖减弱。PKi67(红)和DAPI(蓝)染色显示pgc-1α过表达的神经干细胞。Q消融c-myc介导的线粒体生物发生调节因子pgc-1α(n=6,10,1)的增殖作用。R共染色GFP(绿色)、Ki67(红色)、Sox2(白色)和DAPI(蓝色)。慢病毒介导的c-MycOV在体内显著增加，而c-MycKD显著降低海马神经干细胞增殖(n=)。所有数据均以平均扫描电镜值表示。采用未配对t检验分析两组间的差异。*P0.05;**P0.01;***P0.;没有意义
为了促进机制研究，我们切换到体外HCN（海马NSC）培养系统5，该系统可以模拟体内可逆的NSC静止和激活转变（补充图S2）。在体外，c-Myc的表达在转变过程中是高度动态的，在aNSCs中比在qNSCs中高得多（图1c和补充图S1e）。静止诱导后半小时，c-Myc转录物已经减少了2倍，在1.5-6小时时减少了到10倍（图1d和补充图S1f）。使用c-Myc蛋白观察到类似但不太显着的下降（图1e）。
同时，转录组分析表明，与qNSCs相比，aNSCs中有个基因上调，个基因下调。Sa，b).通过对上调基因启动子的进一步转录因子结合基序富集分析，确定了候选基因名单(图1)。1f).其中c-Myc不仅表达量最高，而且在NSC静止和活化转换过程中动态表达最强(图。1g及附图。Sc，d).在差异表达的/个基因中，超过9%(/)在dna编码数据库中证实了c-Myc结合(补充图)。Se).其中细胞周期和线粒体途径基因高度丰富(图)。1h及附图。Sf-h).我们从上调组随机抽取6，Hsp90ab1，Hspd1，Tmem11，从下调组随机抽取Cyp1b1，Hint2，Rdh14，在预期的NSC状态下，c-Myc与启动子的结合强度适中。Si，j).综上所述，c-Myc可能通过协调细胞周期状态和线粒体活性来调节NSC的静止和活化。
为了证实这一点，我们利用体外培养模型系统过度表达和敲除c-Myc并进行转录组分析。S4a，b).同样，c-Myc对细胞周期和线粒体途径基因的改变最为显著。4c，d和Fig。1i).透射电子显微镜观察发现，神经干细胞的线粒体嵴较厚且组织良好，而神经干细胞则稀疏、支离破碎、紊乱。1j，k及补充图。S5a).与神经干细胞相比，神经干细胞中的线粒体肿胀且不成熟，因此其活性也受到损害(补充图。第5b条)。在神经干细胞中，约有5%的线粒体处于非活性状态，而在神经干细胞中只有不到10%的线粒体处于非活性状态。第5b条)。神经干细胞中ATP的产生也明显减少(补充图。S5c).与上述分子变化一致的是，c-Myc在qNSCs中的过度表达逆转了线粒体形态学改变和平静诱导时典型的嵴消失(图。1l，m).相比之下，c-Myc在aNSCs中的击倒使线粒体趋于静止状态(图)。1l，m及附图。S5d).结果c-Myc过表达增加，shRNA表达降低ATP产量(补充图。S5e).
与线粒体重构的转变相一致，c-Myc过表达促进了细胞在静止状态下的增殖，降低了G0期细胞的百分比，而在活化状态下则没有。1n，o及附图。S6a，b).与此相反，在激活条件下，c-Myc基因敲除可引起细胞周期阻滞，增加G0期细胞的百分比，而在静止条件下则不会。1n，o及附图。S6a，b).重要的是，线粒体生物发生的调节因子pgc-1α和线粒体活性抑制因子NaN均能有效地阻断c-myc介导的NSC激活(图。1p，q及补充图。提示c-Myc至少部分通过控制线粒体重构来调节静止和活化转换。
然后在成年人海马体内立体定向注射载体-、c-MycOV-和KD-GFP慢病毒。本研究采用c-Myc与绿色荧光蛋白(GFP)联合染色的方法，对c-Myc过表达和/或敲除成功后的体内实验结果进行了验证。结果表明，c-MycOV和c-MycKD具有相反的增殖作用。1r).c-MycOV组中，GFP+细胞中Ki67+细胞的比例明显高于c-MycOV组(58%±10%;c-MycKD组(%±2%;对照组(18%±%;n=)(Fig.1s).它们的形态也大不相同(补充图。S6g).基本上所有的c-MycOV-GFP细胞都失去了RGL形态，采用aNSC/早期祖细胞形态，而Vector-GFP细胞则两者兼有。c-MycKD-GFP细胞主要保持RGL形态(补充图。6g，h).这是可以预期的，并表明天c-Myc过表达足以激活不能保持静止的高表达c-Myc和天c-Myc击倒足以阻止未经c-Myc上调而很少被激活的感染细胞。
总之，本研究揭示了c-Myc通过协调代谢重编程(如线粒体重塑)与细胞周期状态在NSC静止和活化稳态中的中心作用。我们的工作还例证了如何利用体外模型，以获得一个如何静止和激活协调通过主细胞周期和代谢控制器，如c-Myc的综合理解。利用体外培养模型系统在全基因组范围内分阶段描述不同的主控制器(如c-Myc、REST、E2F1和Ascl1)如何在时间和空间上拮抗和协调NSC的静止和激活，是目前研究的热点。系统地理解转变及其动力学将有助于揭示神经再生疗法的新策略。
数据可用性
用于和/或分析以支持本研究结果的数据集可在本文或补充信息中获得。任何其他支持本研究结果的原始数据均可根据合理要求从通讯作者处获得。
