目前构建的工程化心肌组织往往不具有复杂的腔室结构，难以进行压强-体积动力学评价及超声心电图等相关临床检测，从而不能与临床中心脏生理/病理数据直接比较，限制了其在再生医学和体外病理研究等方面的进展。哈佛大学KevinKitParker课题组年在NatureBiomedicalEngineering期刊上发表“Atissue-engineeredscalemodeloftheheartventricle”，体外构建了工程化的心室组织，并成功应用于心率失常的病理模型。
工程化心室组织与病理模型构建
体外心脏模型对于研究心脏在生理和病理状态的功能机制以及测试可能的治疗手段具有重要意义。体外心脏模型横跨从微尺度的细胞水平检测、工程化心肌组织（EngineeredHeartTissues,EHT）到心肌器官芯片系统(Organ-on-a-Chip)等多个尺度。除了检测心肌的收缩力和电生理特性等功能，心室的压力-体积动力学特性(Pressure-VolumeDynamic)也同样重要。目前常用于心室压力-体积动力学评价的模型主要为动物模型或离体心脏，但其在基因表达、生理学和疾病病因等方面存在巨大差异，限制了其在开发和评价心脏治疗性干预方法的应用。因此，开发基于人体心肌细胞的体外心脏模型成为当务之急。利用生物制造方法和新兴的3D打印技术，可以构建基于诱导多能干细胞衍生来源心肌细胞（iPSC-CMs）的功能化心肌组织，然而多为补片或条带，虽然具有接近人体心肌的电生理特性和药物反应性等功能，但却由于缺乏腔室结构无法检测心室的压力-体积动力学特性，从而其实验结果无法直接与动物模型和临床数据进行比较。目前已有一些研究主要采用心脏类器官形成腔室结构，虽然可以测量心室压力变化，但各向同性的水凝胶显然缺乏合适的微拓扑结构，无法诱导心肌细胞定向排列形成心脏特有的层状结构。因此，考虑到定向纳米纤维可以诱导心肌细胞的取向排列，本研究采用纺丝工艺（Pull-spinning）构建了纤维状的心室支架，并种植心肌细胞形成功能性的心室组织。
图1.心室纤维支架的结构示意图和细胞取向排列特性
纺丝工艺构建纤维状心室支架
在天然心脏中，心肌细胞外基质（ECM）提供必要的纳米拓扑定向结构，引导心肌细胞定向排列成心肌纤维束，并重叠形成独特的螺旋状薄片结构（4~6个细胞厚度）。基于此生理结构，本研究：
采用pull-spinning工艺（如图2），并通过旋转的椭球状收集器进行收集，待纺丝结束后脱模得到心室状定向纤维支架；
采用PCL/明胶（gelatin）复合材料，其中PCL具有良好的结构强度，gelatin具有优异的生物相容性；
采用静态细胞滴种方式，将乳鼠心肌细胞（NRVM）或人iPSC-CMs种植在支架表面，并在搭建的生物反应器中进行灌注培养，同时进行压力-体积动力学特性的在线实时检测。
图2.心室状定向纤维支架的pull-spining成形工艺
体外心室模型功能评价
结构和力学表征
扫描电镜结果显示PCL/gelatin纤维支架与脱细胞ECM的结构接近，而且X光电子能谱结果证明gelatin能够在水溶液中维持4天以上；同时，PCL/gelatin纤维支架具有显著的各向异性特征，在平行和垂直于纤维方向的弹性模量分别为±31kPa和74±15kPa。
图3.心室状纤维支架的形貌和力学特征
细胞实验和心肌功能评价
培养3~5天后，观察到工程化心室组织的整体、同步跳动；免疫荧光结果证明心肌细胞的定向排列（取向度在0.9左右，而1为完全定向），以及细胞在工程化心室内部的均匀分布；心室厚度约为0.2mm，约为5~10个细胞层厚度，而大鼠心室的厚度约为2mm，约为个细胞层厚度；钙瞬变染色结果揭示了工程化心室组织表面的连续电信号传导，其中鼠、人来源的心肌细胞的钙波传导速率分别为9.33cms-1和5.2cms-1，这与之前文献报道接近。
图4.工程化心室的形貌结构和钙成像结果
压强-体积动力学评价
利用导管插入术（Catheterization）实现了对工程化心室内压强和体积变化的实时测量，并通过时域和频域分析心室的输出功能。其中，射血分数（Ejectionfractions）和搏出功（strokework）分别为0.2%（约相当于正常心脏的1/~1/50）和0.05mmHg×μl（约相当于正常心脏的10-8~10-4）。进一步，测试了其在不同浓度的肾上腺素（β-adrenergic）作用下的药物反应性，在跳动频率增加的同时，观察到肾上腺素诱导的搏出功下降，这与临床生理反应一致。
图5.工程化心室的压力-体积动力学特性检测
室性心动过速的病理模型构建
在病损心肌组织中，由于心脏解剖结构的变化引起脉冲传导的异质分布，从而导致室性心动过速，即在缺陷处形成螺旋波。本研究通过在工程化心肌中构建孔洞缺陷（直径1mm）来构建室性心动过速的病理模型，并比较其在引入缺陷前后的钙传导活动，观察到：
电信号传播从原来的平面波（planewaves）变成围绕缺陷处的螺旋波（spiralwaves）；
双孔洞缺陷的病理模型会产生反向传播的螺旋波，并在两孔洞间的区域内融合；
正常和病理模型都表现出恒定的传播速率，约为4~5Hz。
图6.结构性心律失常疾病模型
结论
目前组织工程心肌虽然能提供一些心肌收缩和电生理特性的评价，但仍然依赖于动物模型来检测心室压强-体积动力学特征等心脏生理功能。本研究采用纺丝工艺和细胞种植结合来构建工程化心室组织，其中定向纳米纤维模拟心肌ECM诱导心肌细胞的取向排列，并通过导管插入术来实时评价心室的压强-体积动力学特征。该研究首次在组织尺度上评价了心室的搏动输出功能，并成功将其应用于心率失常模型的构建，为体外心脏学的相关研究提供了新的平台，将极大促进其在临床应用上的转化。
参考文献
MacQueen,L.A.,etal.,Atissue-engineeredscalemodeloftheheartventricle.NatureBiomedicalEngineering,.2(12):p.-.(DOI:10./s---5)
