你我携手共抗白癜风 http://pf.39.net/bdfyy/bdfzg/171021/5779521.html什么是原代细胞培养?
顾名思义，从体内分离出来的组织或细胞的第一次培养称为原代培养。更成熟的概念是，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。
原代细胞培养的步骤：取材→分离→培养和维持
1、取材
人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。
(1)取材的基本要求
①取材要注意新鲜和保鲜
②应严格无菌
③防止机械损伤
④去除无用组织和避免干燥
⑤应注意组织类型、分化程度、年龄等
⑥作好记录
2、分离
人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。
(1)悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
(2)实体组织材料的分离方法
对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。
①机械分散法
特点:简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。
②消化分离法
组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
胰酶消化法-实验步骤
一、实验材料准备
1.Hanks液配方：KH2PO40.06g，Nacl8.0g，NaHCO30.35g，KCl0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O0.06g，加H2O至ml。
Hanks液可以高压灭菌。4℃下保存。二、具体操作
1.将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2.用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3.用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4.视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5.加入3-5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6.静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7.rpm，离心10分钟，弃上清液。
8.加入Hanks液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9.加入培养液1-2ml（视细胞量），血球计数板计数。
10.将细胞调整到5x/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
注意事项
1.自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2.在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3.凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
4.操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
5.点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
6.操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
7.不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
8.瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
9.吸溶液的吸管等不能混用。
3、原代细胞的培养和维持
(1)原代细胞的培养方法
①组织块培养法
组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。
②消化培养法
③悬浮细胞培养法
对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。
④器官培养
器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。
其他注意事项：
（1）原代培养材料的选择，尽量选取繁殖能力较强的组织，如胚胎、幼小的生物体或者肿瘤组织等。
（2）要注意无菌操作。
（3）整个取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇时间1min左右，不能过长，以确保胚胎细胞活性。
（4）运用消化法时胰酶温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1~10min，而是至少20min，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中继续消化了10min以上。所以胰酶不能作用过强，否则这些细胞易被损伤而不易生存。
（5）如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养液接触，匆使组织块漂浮起来。如果组织块没有黏壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上，从而因不能观察到而无法收集到生长的细胞。
（6）原代培养操作时，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗涤子宫、胚胎或组织块等。
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