北京哪家医院的白癜风专科好 https://yyk.39.net/bj/zhuanke/89ac7.html自噬，简单来说就是细胞自己吃自己、废物再利用。细胞陷于困境时(如营养物质匮乏)，启动自噬程序自救，通过降解蛋白质和细胞器获得必需的氨基酸、脂肪酸等营养物质维持基本生命活动，以便死中求生。一直以来，自噬都是生命科学领域的研究热点。年8月17日，图卢兹大学综合生物研究中心ArnaudBesson教授团队，在期刊Naturecellbiology中发表的自噬相关文章(图1)，阐明了自噬与细胞周期调控的新机制。图1.p27调控自噬-溶酶体途径，协调细胞周期和生长背景介绍p27Kip1(p27)被认为是细胞周期蛋白CDK的抑制因子，具有诱导细胞周期停滞的能力。营养匮乏往往是自噬发生的主要诱导原因，已有研究表明，细胞质中的p27是自噬的正调节剂(葡萄糖匮乏或者血清剥夺的条件下)，它可以保护细胞免受应激诱导的细胞凋亡。但是，p27调控自噬作用的具体分子机制仍然是未知的。接下来，M君和大家一起来看看，关于自噬调控，作者团队做了哪些精彩的工作。p27调控细胞自噬
作者团队通过研究p27+/+MEFs和p27-/-MEFs应对氨基酸剥夺后自噬的变化，证明了氨基酸缺乏的细胞中，p27促进自噬。
细胞：
p27+/+MEFs:p27野生型(p27+/+)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)，源于p27野生型小鼠胚胎。
p27+/+MEFs:p27缺失型(p27-/-)MEFs，源于p27缺失的小鼠胚胎。1、p27促进自噬发生LC3B-II是自噬小体的标记物，位于自噬体膜，与溶酶体融合时被降解。氨基酸剥夺的短时间内，如图2a所示，p27+/+和p27-/-小鼠胚胎成纤维细胞中，LC3B-II表达水平相似，随着氨基酸剥夺时间的延长，p27-/-中的LC3B-II表达水平明显会更高，并且在48小时表现出显著统计学差异(图2b)。在随后的实验中，选择48小时作为氨基酸的长时间剥夺的诱导时间。图2c的LC3B的免疫荧光染色同样也呼应这一观察结果(红色箭头)。这表明p27可促进氨基酸剥夺细胞中的自噬。图2.氨基酸剥夺不同时间，细胞中LC3B，LC3B-I和LC3B-II的表达
2、p27调控自噬流的检测
自噬是一个多步骤的动态过程，当应答营养匮乏的压力时(如氨基酸或葡萄糖缺乏)，细胞接受自噬诱导信号，随后会在胞浆处形成一种扁平的叫做吞噬泡(Phagophore)的双层膜结构。紧接着，吞噬泡不断延伸，包裹一些细胞元件或者自噬物(Autophagiccargo)，形成密闭的球状的自噬小体(Autophagosome)。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体(Autolysosome)，自噬体中的内容物被溶酶体中的酶降解，降解产生的营养物质会被细胞重新利用。
在整个过程中，细胞将自噬物吞噬到自噬小体，直到最后自噬溶酶体形成并降解自噬物的这个过程被称为自噬流(Autophagicflux)(图3)。自噬流中的任一环节出现障碍自噬都无法完成其生物学功能。
图3.细胞应答营养匮乏压力时，自噬发生的示意图[2]LC3B-II通常是自噬小体的Marker，哺乳动物细胞内LC3B的总量通常不会有巨大波动，一般只会出现LC3B-I和LC3B-II间的相互转换。如果LC3B-II表达增加，可能是由于前期自噬活化后自噬小体增多导致的，也可能是后期自噬溶酶体清除失败使其积累所致。因此，某单一时间点的LC3B-II的表达改变并不能体现自噬流的改变。在文章中，使用了WB检测蛋白、免疫荧光，mCherry-eGFP-LC3B双荧光系统的组合测量方法，检测p27+/+和p27-/-MEFs自噬流。(1)氯喹(Chloroquine，CQ)处理，检测自噬流中LC3B-II变化在酸性溶酶体中，氯喹会使溶酶体pH值升高，使溶酶体中酸性水解酶失活，从而抑制细胞内自噬溶酶体的融合与降解。氯喹处理细胞会导致LC3B-II的聚集，此时观察到的LC3B-II的变化仅代表自噬小体数量的改变。
氯喹处理细胞后，在短期氨基酸剥夺的条件下(0-4h)，两种细胞的自噬通量是相似的(图4a,b)。但是随着时间的增加，长时间的氨基酸剥夺处理后，p27-/-MEFs与p27+/+MEFs相比，LC3B-II数量显著降低(图4c,d)。这说明p27促进氨基酸缺失细胞中自噬通量。
图4.氯喹影响细胞LC3B-II的表达
(2)p62/SQSTM1在细胞中的积累
p62也称为SQSTM1蛋白，作为一种调节因子参与自噬体的构成，具有底物的特异性，是连接LC3B-II与待降解泛素化底物的桥梁。p62结合泛素化蛋白进入到自噬体后最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而得到清除(图5a)。自噬流被抑制时，p62/SQSTM1会在自噬流受损的细胞中积累,在细胞内整体p62水平的表达与自噬活性存在负相关。
如图5b所示，随着时间的增长，p62在氨基酸缺乏的p27-/-细胞中的表达量更高，p27-/-细胞的自噬流受损，这进一步说明了，p27可以促进自噬流活化。
图5.p62在自噬流受损的细胞中积累
(3)mCherry-eGFP-LC3B双荧光系统检测自噬体与自噬溶酶体。
mCherry(红光)-eGFP(绿光)-LC3B串联荧光蛋白可用于检测自噬流水平的融合蛋白。它利用了酸性自溶酶体和中性自噬体之间的pH差异以及不同荧光素对pH的敏感性差异，以监控从自噬体到自溶酶体的进程(图6a)。
图6.串联荧光探针及荧光共定位检测自噬流
如图6a-b，mCherry荧光基团的pH值稳定性比GFP高，GFP荧光信号在进入溶酶体后由于pH值的下降会出现淬灭，而mCherry荧光基团进入溶酶体后仍能发出荧光。因此若细胞内出现绿和红色荧光共定位，即出现*色荧光时，表明：mCherry-eGFP-LC3B融合蛋白并未与溶酶体发生融合,说明了自噬流被阻断。当细胞内仅出现红色荧光而无绿色荧光时，代表mCherry-eGFP-LC3B融合蛋白定位于溶酶体或自噬溶酶体内，即自噬流活化。
与p27+/+细胞相比，p27-/-细胞中自噬溶酶体的比例下降(72%vs95%)，进一步表明p27促进自噬流(图6b-c)。
(4)p27促进自噬体成熟
图7.p27促进自噬体成熟过程的中间体形成
之前有文献表明(参考文献5)，自噬体在成熟过程中，LC3B阳性自噬囊泡会聚集在细胞核周围形成环状聚集结构，这种结构被认为是自噬体成熟过程中的中间结构。如图7a所示，p27+/+细胞中有明显的环状聚集体，但是在p27-/-细胞中很少观察到，取而代之的是小囊泡结构。这表明p27可促进自噬体成熟过程。
总结
1、在长期氨基酸剥夺的情况下，与p27-/-细胞相比，p27+/+小鼠胚胎成纤维细胞中LC3B-II的上调，p62蛋白表达量减少，自噬溶酶体数目比例增加，以及自噬体成熟过程环状聚集体的形成，可以证明p27在氨基酸长期匮乏的细胞中促进自噬流活化。
2、自噬流在细胞内是流动的细胞代谢过程,自噬流中的任一环节出现障碍自噬将无法完成其生物学功能。尚无某种单一方法可以绝对准确特异的检测自噬，因此应该使用组合的实验方法来评估自噬活动(自噬相关工具药物的使用，WB检测自噬相关蛋白变化，免疫荧光共定位，以及mCherry-eGFP-LC3B双荧光检测等)。
原文链接：DOI:10./s---4.
相关化合物
ChloroquineChloroquinephosphate
Autophagy和Toll-likereceptors(TLRs)的抑制剂。
BafilomycinA1
抑制自噬(Autophagy)且诱导凋亡(Apoptosis)。
Hoechst
发蓝色荧光的DNA染料，可以透过细胞膜。
E64d
溶酶体蛋白酶抑制剂，可用于自噬流检测。
Leupeptin
溶酶体蛋白酶抑制剂，可用于自噬流检测。
PepstatinA
溶酶体蛋白酶抑制剂，可用于自噬流检测。
自噬激活剂
包含Rapamycin，MG-等+种有效的自噬激活剂。
自噬抑制剂
包含3-Methyladenine(3-MA)，Resatorvid(TAK-)等近种有效的自噬抑制剂。
自噬化合物库
收录了+种自噬信号通路相关的产品，是研究自噬相关调控及疾病的有用工具。
参考文献
1.AdaNowosad,etal.p27controlsRagulatorandmTORactivityinaminoacid-deprivedcellstoregulatetheautophagy-lysosomalpathwayandcoordinatecellcycleandcellgrowth.NatCellBiol.Aug17.2.PrashantaKumarPanda,etal.ChemicalScreeningApproachesEnablingDrugDiscoveryofAutophagyModulatorsforBiomedicalApplicationsinHumanDiseases.FrontCellDevBiol.Mar19;7:38.3.MariaCondello,etal.TargetingAutophagytoOver
