DEAE-Dextran细胞转染试剂盒
产品货号：T
产品规格：T/T
产品简介：
外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖(Dextran)转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。DEAE-葡聚糖转染法的原理是带正电荷的DEAE-葡聚糖不带负电的核酸的磷酸骨架相互作用，形成复合物，该复合物通过细胞内吞噬作用使DNA转导进入细胞核。
DEAE-Dextran细胞转染试剂盒(DEAE-DextranCellTransfectionKit)适用于瞬时转染(transienttranfection)，不宜用于筛选稳定表达细胞株，这是因为DEAE-dextran在较高浓度作用较长时间会对细胞产生一定毒性。氯喹的加入可以抑制溶酶体对外源DNA的降解，从而提高转染效率。但对于具体的细胞、具体的培养条件，如需获得更加理想的转染效率，须自行摸索上述各种转染方法，找出优化的转染方法。CHO、DUKX、BⅡ等细胞也可以通过甘油、DMSO进行热休克处理以提高转染效率。
产品组成：
自备材料：
1.胰蛋白酶消化液
2.完全培养基
3.PBS、无菌水
操作步骤(仅供参考)：
（一）常规转染：
1.在转染前24h用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度达50～70%即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。
2.弃培养液，用PBS清洗细胞2次，再用TBS-Dbuffer清洗1次，吸尽残液。
3.配制转染液:对于6孔板，按照下表依次加入8μlDEAE-Dextran，2μlDNA以及适量的TBS-D，使其总体积为μl，即为DEAE-Dextran-DNA-TBS-D转染液，用移液器轻轻吹打混匀，但不宜采用离心或Vortex等剧烈方式。
备注：对于六孔板中一个孔的细胞，DNA可以在1～3μg的范围内进行适当调节。最佳的转染条件，因具体的细胞和培养条件而定，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。对于其它培养板或培养器皿，试剂的用量可大致按照细胞培养面积按比例换算。
4.转染：把μl转染液滴加到细胞表面，轻轻晃动6孔板，使其不细胞表面充分接触，37℃孵育20～40min，观察细胞至皱缩变圆为止。
5.参考上表，每孔缓慢加入1.7ml细胞培养液(约DEAE-Dextran-DNA-TBS-D转染液体积的10倍)。
6.可选步骤：参考上表，每孔加入17μlChloroquinesolution，亦可和上一步骤中1.7ml细胞培养液预先混合后一起加入。
7.培养不超过2h或在出现明显的细胞毒性前，更换新鲜培养液继续培养，通常转染后48～72小时可以检测转染效果。
（二）预处理转染：
1.在转染前24h用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度达50～70%即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。
2.弃培养液，用PBS清洗细胞2次，再用TBS-Dbuffer清洗1次，吸尽残液。
3.配制转染液:对于6孔板，按照下表依次加入0.1mlDEAE-Dextran、0.9mlPBS，使其总体积为1ml，即为DEAE-Dextran工作液。
4.预转染：对于6孔板，把1ml转染液滴加到细胞表面，轻轻晃动6孔板，使其不细胞表面充分接触，37℃孵育10min。
5.洗涤：弃液，用TBS-Dbuffer轻轻清洗1次，PBS轻轻清洗1次，注意防止细胞脱落。
6.弃洗涤液，参考下表，每孔缓慢均匀加入μDNA工作液。
7.37℃孵育30min，参考下表，每孔缓慢加入1.7ml细胞培养液(约DNA工作液体积的10倍)。
备注：对于六孔板中一个孔的细胞，DNA可以在1～3μg的范围内进行适当调节。最佳的转染条件，因具体的细胞和培养条件而定，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。对于其它培养板或培养器皿，试剂的用量可大致按照细胞培养面积按比例换算。
8.可选步骤：参考上表，每孔加入17μlChloroquinesolution，亦可和上一步骤中1.7ml细胞培养液预先混合后一起加入。
9.培养不超过4h或在出现明显的细胞毒性前，更换新鲜培养液继续培养，通常转染后48～72小时可以检测转染效果。
注意事项：
1.注意无菌操作，尽量避免污染，同时DNA不应含有蛋白和酚。
2.休克处理某些细胞系会使转染效率大大提高，但应注意甘油暴露过久易导致细胞死亡。
3.转染12～24h后，可以加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠溶液，可以提高病毒滴度。
4.如果转染效率低下，有可能是过多细胞死亡所致，应考虑减少DEAE-Dextran的用量或作用时间，或者减少氯喹作用时间。
5.支原体污染细胞，易导致转染不稳定。
有效期：6个月有效。
