微观物流蛋白马达通过在DNA上的定 [复制链接]

撰文｜言笑

责编｜酶美

一个活细胞就是一个微型工厂，在这里，各种各样的分子机器不断地工作，以执行基本的生命过程。细胞内运输是细胞内微观物流的基础，由生物分子马达（motors）提供动力。真核细胞内的motors，如肌球蛋白（myosin）、驱动蛋白（kinesin）和动力蛋白（dynein）沿着特定的细胞骨架轨道运动，对细胞内材料进行分类、驱动和组装。这些以蛋白质为基础的motors在细胞中表现出自主的、长距离的运输，因此模拟转运的体外应用被广泛研究。然而，轨道设计和控制中的不灵活性阻碍了实际应用。相比之下，DNA轨道比细胞骨架轨道更具优势，例如DNA轨道高度稳定，可以精确地设计成所需的三维结构，并在单碱基水平上进行控制。DNA序列识别的特异性对于在微尺度环境中传递信息和编程反应非常有用，可再现细胞中的活动。使用DNA轨道可以采用“DNA步行器（DNAwalkers）”作为motor。DNAwalkers是一类特定DNA结构在链置换或酶催化反应驱动下沿特定轨道定向移动的DNA纳米机器。目前，研究人员已设计构建了各种轨道精确、自动运行的DNAwalkers，并应用于药物输送、生物分子检测、细胞成像等诸多生物医学领域中。但这些DNAwalkers速度非常缓慢或采用“烧桥（burnt-bridges）”策略（即它们的轨迹只能使用一次），因此DNAwalkers的持续操作和重复利用仍然具有挑战。

年3月11日，来自日本国家信息和通信技术研究所的Ken’yaFuruta团队在Science杂志上在线发表了一篇题为ProgrammablemoleculartransportachievedbyengineeringproteinmotorstomoveonDNAnanotubes的研究论文，开发了一种可以在DNA纳米管上移动的蛋白马达（proteinmotors），其在DNA上的移动速度比相应的DNAwalkers快倍，这些motors还可以重复使用它们的轨道。新的motors和基于DNA的纳米结构使作者能够在轨道上排列结合位点，进而局部控制运动方向，并通过不同的motors实现货物的多路运输。这些技术的综合应用构成了微尺度的货物分拣器（sorters）和整合器（integrators），可自动在支链DNA纳米管上按照DNA序列编程进行分子传输。

首先，作者使用模块化蛋白质工程来构建能在DNA纳米结构上移动的杂合马达（hybridmotors）：如图1A所示，选择dynein作为motor，用来源于不同物种的转录因子的DNA结合域（DNA-bindingdomains）取代dynein原来的轨道结合结构域（originaltrack-bindingdomain）。为了评估这些motors的活性，作者进行了滑行测试（glidingassays）：将motors固定在玻璃表面，使DNA纳米管在其上滑行（图1B-1C）。数据表明，（1）在19种DNA结合域中，有11种以特定的序列方式介导DNA纳米管轨道的定向运动；（2）DNA纳米管的平均速度（5.3~nm/s）高度依赖于hybridsmotors的类型；（3）Dynein的motor结构域的ATP水解活性对DNA纳米管运动至关重要。

图1.（A）杂交马达的构建；（B）滑行实验示意图；（C）DNA纳米管结构示意图

随后，作者对DNA轨道整体结构进行设计（这一特性是目前细胞骨架无法实现的），制备了两种类型的DNA纳米管：single-strandedtile（SST）和double-crossover（DX）tile。SST管的每个横截面只有一个结合位点，而DX管有多个结合位点，可以以螺旋或方格进行排列（图2）。所有类型的DNA纳米管都可以在hybridmotors包被的表面上定向移动。与SST管相比，每段含有3个结合位点的DX管移动速度快4倍。作者推测DX管上结合位点越多将有助于motor更快地识别结合位点。然而，当每段结合位点的数量增加到6个时，速度减慢了大约2倍，这与天然生物分子motors中的现象一致，说明太多motors的结合将成为彼此的阻力。因此，在后续的实验中，主要使用每段包含3个结合位点的DX管。

图2.不同类型的DNA纳米管结构示意图

Hybridmotors的传输方向可以通过翻转DNA纳米管中识别序列的方向进行编程。在细胞中，当没有货物时，细胞质中的dynein通过motor结构域的自二聚化（self-dimerization）而自抑制（autoinhibited）。因此，作者构建了一个人工二聚体（ACTNrod-LEF1-Dyn），通过a-actitin的刚性棒状域分离motordomain，从而将motordomain从自抑制中释放出来。合成的单个人工二聚体在DNA纳米管上表现出定向运动，足以满足微米尺度的系统。DNA轨道上的分子分类和整合等功能需要通过连接不同的DNA轨道来实现，因此，作者分别构建了“分散器”（disperser）和“聚合器”（aggregator）：在disperser中放置LEF1识别序列，使LEF1-Dyn从Y形轨道的中心移动到外围；在aggregator中则设置为相反的方向。与预期结果一致，荧光标记的货物可以被成功分散或聚集。

最后，作者使用两种不同的转运蛋白实现一个更精细的系统，每个转运蛋白在轨道上只识别一种DNA序列而不会相互干扰。Sorters具有高特异性，错误分拣货物的比率仅为3.0±0.3%。Integrators与sorters相反，具有一个交汇点——LEF1和dE4轨道合并为LEF1+dE4轨道。Integrators可以成功地将两种类型的货物整合至一条单轨上。通过进一步分析，作者发现通过修改DNA轨道的序列可以调节速率差异，进而控制系统的效率。

总的来说，该研究开发了新的蛋白马达，可直接在DNA纳米结构上附着和移动，并实现分子货物的定向运输。该研究中开发的蛋白马达在DNA纳米结构上实现了快速行走（平均nm/s）和定向移动，并且不会破坏轨道，这些特性将有利于将来的实际应用。同时，与细胞骨架轨道不同，蛋白motors允许灵活设计其轨道，从而实现高度可控的运输和驱动系统。

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