原创医学参考报干就有未来
撰文│娄艳茹
编辑│郑天慧
审校│汤红明
逆向工程原理可构建一种模拟体内环境的体外培养系统，随分化阶段优化调整培养条件，促使胚胎细胞和类器官向更成人样的表型转变，为解决目前hPSCs在药物研发和再生医学中遇到的障碍提供了新的方向。
人类胚胎的发育过程已经通过非洲爪蟾、斑马鱼、鸡和小鼠等动物模型进行了研究。由于动物模型生物学和伦理限制，人胚胎发育后期并未进行很深入地研究。多能干细胞(PSCs)包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞(iPSCs)，近期，作为胚胎的一种体外替代物，用于细胞分化的基本分子过程研究。
一、多能干细胞的体外分化
人ESCs和iPSCs体外分化产生的肠、肝、胃、肺、肾和脑细胞及其类器官显示出不成熟的表型，将这些细胞移植到动物组织中可以诱导这些未成熟细胞的成熟。表明这些细胞有成熟的潜力，同时目前的体外培养系统尚不能完全模拟体内环境，主要原因在于对人类胚胎后期发育阶段的认识不足，如肝脏成熟主要发生在围产期，目前对围产期肝脏发育过程中微环境、细胞、分子水平的变化还没有完全了解。
二、多能干细胞体外分化成熟的影响因素
利用复制体内系统的内部工作原理即逆向工程的原理，可构建一种模拟体内环境的体外培养系统，该方法可通过引入“成熟因子”，并随分化阶段优化调整培养条件，以促使胚胎细胞和类器官向更成人样的表型转变，最终达到改变最少细胞内、细胞外基质和细胞龛成分，产生成熟的、功能性的细胞。“成熟因子”指细胞分泌的蛋白质或化学因子，包括细胞-细胞相互作用因子、细胞-细胞外基质相互作用因子、循环体系的激素、微生物衍生因子、电信号等。
（一）细胞外基质对多能干细胞分化的影响
细胞体外分化使用的可溶性因子，一直是研究重点，具有获取方便、使用简单的特点，也是细胞外基质（ECM）的重要组成部分。ECM有机械效应、化学效应、生物学效应，ECM的组成、拓扑结构、几何结构和刚度可以影响细胞分化和组织稳态。囊胚中的干细胞龛是一个动态的、可变化的环境。它短暂地支持干细胞的增殖，一旦受到变化的影响，可以促进干细胞分化为具有成人命运的功能性三维组织。
ECM的成分会随着细胞发育而改变。在细胞分化各个阶段都需要特定类型的ECM构成复杂的环境。研究发现人肝祖细胞产生的脱细胞基质（ACM）支持定型内胚层（DE）向肝脏分化，经过鉴定ACM中的laminin-和laminin-可以有效诱导DE细胞的肝脏分化，表明细胞特定发育阶段的基质在干细胞命运中起着重要作用。
理想的三维体外分化基质具有可去除、可支持三维球体形成的特点。为了模拟干细胞龛的动态特性，复旦大学药学院娄艳茹课题组使用纳米微纤纤维素（NFC）水凝胶构建了人PSCs三维柔性培养系统，NFC水凝胶可通过纤维素酶降解，留下完整的3D-hPSC球体，然后在新的环境中进一步培养分化。柔性3D培养系统可模拟体内微型组织或类器官，使用原子力显微镜-胶体探针技术发现NFC水凝胶对hPSC的黏附力很低，hPSCs与基质的相互作用很小，细胞-细胞相互作用远高于细胞-基质的相互作用，这可能是NFC水凝胶能够有效保持细胞球体形状的主要原因。
为了模拟体内细胞微环境，可根据不同细胞类型的物理和生化特性设计不同的细胞基质。例如，通过改变水凝胶或支架中的微孔，可形成不同形状和尺寸的类器官。通过研究动物、人体组织、器官在发育过程中ECM内源性成分的动态变化，并在体外培养中对ECM和特定成分进行检验，将能够确定细胞和类器官培养分化所需的ECM最少和基本成分。
（二）非实质性细胞对多能干细胞分化的影响
在hPSCs分化成熟中，除了ECM和生物材料发挥重要作用外，“成熟因子”还可以是细胞。如在颌下腺上皮细胞培养中加入颌下腺间充质细胞有利于分枝和形态分化。在类器官形成中，实质细胞(如肝细胞和小肠上皮细胞)，一直是研究热点。非实质细胞(如神经细胞、间充质细胞和血管细胞)，在发育和组织功能方面的作用已被充分证明，尤其在依赖多个生殖层谱系的器官系统。
目前，类器官的形成缺乏不同细胞类型的共同诱导。将PSCs分化的祖细胞按顺序添加到复合类器官中，可以增加对特定细胞-细胞相互作用的控制，以更好地模拟胚胎发育过程。比如神经嵴细胞加入人肠道类器官中后可分化为包括神经元和神经胶质细胞在内的非实质细胞类型，产生具有完整肠神经系统的人肠道类器官，这种胚层复合类器官的整体空间关系，类似于人类或小鼠胚胎11.5天的肠道，虽然没有达到成人水平，但研究显示肠神经系统功能正常。表明胚层复合类器官可以大大增强分化细胞的功能性、成熟性。此外，通过聚集来自两个生殖层谱系的细胞类型，包括中胚层的脐静脉内皮细胞、间充质干细胞、内胚层的肝细胞，可重现成人肝脏的体内细胞特异性，并促进移植所必需的血管化，生成体外人肝芽，该胚层复合类器官可以产生较为成熟的肝细胞。
三、展望
目前在许多疾病研究中，细胞去分化、失去功能，并表现出胎儿不成熟的特征。如肝癌中的肝细胞表现出某些胎儿肝脏的特征，因此通过对细胞成熟的研究很可能对疾病的治疗产生巨大价值。要提高hPSC来源细胞的体外成熟度，还有大量的研究工作需要做，而逆向工程的原理为解决目前hPSCs在药物研发和再生医学中的遇到的障碍提供了新的方向。
专家简介PROFILE
娄艳茹
复旦大学药学院研究员
博士生导师
长期从事人多能干细胞、类器官、组织工程、生物材料、再生医学、基因组编辑等领域的科研，负责研发的用于人多能干细胞三维培养的纳米微纤纤维素水凝胶获世界多国专利并已开发为商业产品。主持多项芬兰科学院、芬兰国家教育局、芬欧汇川公司项目，共计超过万欧元。获授权发明专利9项，发表SCI论文44篇，H-index23。
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