耀菌君的解答室一文全知道菌种建库篇之 [复制链接]

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注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。

前言

在问答中，新入职工作一段时间的小Y关于菌种建库的问题向菌菌询问了一些相关事项，详情可参考《基操篇

耀菌君的解答室——菌种建库篇》。今天小Y关于菌种验证和菌株传代稳定性研究仍有一些疑惑，于是他找到菌菌答疑解惑。

《中国药典年版第三部》中有关传代稳定性的内容是：传代稳定性中应限定生产过程中表达载体细菌或细胞传代（或细胞群体倍增）的最高次数，最高限定代次的确定应基于细胞表型、基因型特性及其所表达基因的分子完整性、一致性，以及生产末期宿主细胞/载体的一致性研究，如质粒拷贝数及其在宿主细胞内的状态，证明上述特征的试验所涉及的传代范围应等于或超过规定的细胞最高限定代次。传代的水平应不超过批准的该菌种用于生产的最高限定代次。最高限定代次应根据研究结果确定，不得超过国际认可的最高限定代次。

只看药典的话，小Y是不是觉得太过抽象了？那菌菌用更加直观浅显的话语来描述一下。也就是说，当我们的菌种株细胞需要进行传代扩增培养时，是需要限定代次的，可以是5代、10代、20代、50代等，但最高代次的限定是根据实验目的和细胞特性来考虑的，例如我们需要预测菌种株的扩培转移到生产规模条件的话，就可以通过传代稳定性培养，察看菌种株倍增情况。可以看看下面关于传代培养的流程图。

接下来菌菌给你说一下菌种建库传代稳定性的大致流程噢~

首先是菌种株的复苏接种步骤，此时将菌种株认为成是0代种子，即种子代次在本稳性研究中定义为P0，这里需要注意的是，种子的来源需要进行确认，这样有利于后续生物制品的注册申报。P0种子可以是贮存在甘油中的甘油菌也可以是贮存在安瓿中的冻干粉剂。

假设P0种子为甘油菌，待室温环境下自然融化，在无菌的环境下按比例接种至选择培养基中，进行扩增培养。

每传1次，则增加1代，直至达到最高限定代次。且每传1代，均需标记菌株信息。

菌种株进行扩增培养后，取活化后的不同代次接种至选择培养基中，进行诱导培养。

然后进行菌种检验，通常检验项目包括培养特性、菌落形态大小、革兰氏等染色方法镜检、对抗生素的抗性、生化反应、培养物纯度、全基因序列测定、目的产物表达量、透射电镜检查、目的基因序列测定、外源基因与宿主基因的检定、外源基因整合于宿主染色体的检定、外源基因拷贝数检定、整合基因稳定性试验、目标产物的鉴别、质粒的酶切图谱等项目，可根据实际需要进行挑选检定。

目前耀海生物具备提供从原始库到工作库的建立的服务能力，RCB建库的法规要求“建立RCB需保证可溯源性，GMP体系下生产对RCB来说为非必须条件，而MCB和WCB必须在GMP车间内完成”，而耀海生物拥有成熟的RCB建库环境以及同时具备GMP体系生产条件。如若需要构建二级菌种库，客户交付RCB的时候需提供完整的例如活菌数、质粒拷贝数、对抗生素的抗性、目的产物的表达量等的检测报告，可提前避免日后的申报障碍。好啦，菌菌要说的就是这么多了噢，如果还有不清楚的可以后台私信菌菌噢~