全转录单细胞RNAm6A修饰鉴定新方法p [复制链接]

N6-methyladenosine(m6A)是真核生物中信使RNA内部最丰富的化学修饰。m6A调控一些重要的转录后RNA过程，包括剪接、转运、稳定和翻译；并且在细胞分化和重编程、胁迫应答、生殖细胞和胚胎建成、肿瘤形成等过程中发挥着重要的作用。由于缺乏高灵敏度、且适用于低RNA/细胞起始量的体内（invivo）m6A全转录组鉴定方法，相对于其他组学（omics，比如转录组、DNA甲基化组、三维基因组等）的陆续报道，哺乳动物早期胚胎发育过程中的m6A修饰图谱长久以来缺乏较好的刻画。

年6月22日，挪威奥斯陆大学（OsloUniversity）ArneKlungland和JohnArneDahl课题组，以及美国密西根大学（UniversityofMichigan）区健辉（KinFaiAu）研究组联合在NatureBiotechnology在线发表研究论文Single-cellm6AmappinginvivousingpicoMeRIP–seq，开发了一种基于抗体的低RNA/细胞起始量的m6A检测新方法picoMeRIP-seq，该方法可以用于全转录组水平鉴定pgPolyARNA、单个斑马鱼、单个小鼠卵子和早期胚胎，以及10个小鼠胚胎干细胞中m6A的修饰图谱。

自从年第一个全转录组m6A鉴定方法发表以来，各种各样的m6A鉴定分析方法已经被开发，包括：（1）基于m6A抗体的，比如PA-m6A-seq、miCLIP、m6A-CLIP、m6A-LAIC-seq；（2）不依赖于抗体的，比如DART-seq、MAZTER-seq、m6A-REF-seq和m6A-SEAL。在这些方法中，DART-seq要求的RNA起始量要求是相对比较低的，为10ng总RNA，而且可以用于单个细胞中m6A的鉴定。由于DART-seq实验过程需要体外转基因表达APOBEC1-YTH，因此，它不适用于研究体内系统（早期胚胎发育过程）中m6A修饰的分析。

得益于作者在低DNA/细胞起始量ChIP-seq实验方面长期积累的经验，他们开发了适用于低RNA/细胞起始量的RNA修饰检测新方法picoMeRIP-seq。在此过程中，一些关键步骤得到系统地优化，包括（1）细胞裂解的策略以及单个实验管中基因组DNA和核糖体RNA的去除；（2）打断/破碎RNA的策略；（3）商业化m6A抗体的选择；（4）抗体结合后RNA的洗涤条件；（5）定制化的测序文库构建。

作者首先用PolyARNA（来自小鼠肝脏组织）和体外培养细胞（小鼠胚胎干细胞）进行了picoMeRIP-seq的评估，证实picoMeRIP-seq可以用于pgPolyARNA和10个小鼠胚胎干细胞起始情况下全转录组水平的m6A鉴定。同时，使用METTL3敲除的小鼠胚胎干细胞以及m6A参考RNA分子（spike-in），进一步证实了picoMeRIP-seq的特异性。接下来，将picoMeRIP-seq应用于RNA含量比较丰富的斑马鱼受精卵（zygote）中，作者观察到即使是在单个受精卵中，如同在多个受精卵样品中效果，依旧可以很好地构建m6A全转录组图谱。

最后，将picoMeRIP-seq应用到单个的小鼠卵子和着床前胚胎，包括GV(germinalvesicle)和MII(metaphaseII)时期卵子以及受精卵（zygote）、2细胞（2-cell）、8细胞（8-cell）、囊胚（blastocyst）时期的胚胎，作者得到了全转录组m6A修饰图谱。主成分分析显示、单卵子/胚胎的m6A修饰可以将各个发育时期很好地区分。m6A修饰区域和基序（motif）分析，得到了和作者之前在多卵子/胚胎一致的研究结果，即m6A主要定位在翻译终止子（stopcodon）附近，并且显著富集经典的m6A模序RRACH(R=G/A,H=A/C/U)。

该研究为将来稀有样品中m6A的功能性研究奠定了技术性基础，比如稀有癌症样品，对于我们了解疾病的发生和进展提供了必备的工具。

ArneKlungland和JohnArneDahl课题组的李艳蛟博士，和区健辉课题组的王运浩博士为共同第一作者。

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