转录因子
转录因子(Transcriptionfactor，TF)也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对基因的转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。TF在植物生长发育和逆境防御反应等过程中具有重要调控作用，对TF及其相互作用因子的功能研究对了解它们在信号级联反应中的作用至关重要，为基础研究及生产应用提供理论依据。
图1从种植物基因组序列中鉴定出的TF家族，共计58个家族(Jinetal.,)。
转录因子的结构
转录因子一般由DNA结合域、转录调控域（包括激活域或抑制域）、寡聚化位点以及核定位信号等4个功能区域组成。
01
DNA结合域（DNA-bindingDomain）
DNA结合域是指转录因子识别顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列，相同类型转录因子DNA结合域的氨基酸序列较为保守，因此，这段氨基酸序列决定了转录因子的特异性。典型的高等植物转录因子家族为WRKY、AP2/ERF、bZIP、bHLH、NAC、MYB等。
02
转录调控域（TranscriptionRegulationDomain）
转录调控域包括转录激活域和转录抑制域两类，它们决定了转录因子功能的差异。同类转录因子的主要区别在于它们的转录调控域各不相同。转录因子的激活或抑制作用依赖于它对靶基因的转录起激活还是抑制作用。转录因子对靶基因的抑制作用可能是通过与其他转录因子竞争同一顺式调控元件进行的。除此之外，还可能存在诸如通过使转录因子二聚化而导致调控域被掩盖，转录抑制域与转录因子相互作用等机制。
03
寡聚化位点（OligomerizationSite）
寡聚化位点是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨基酸序列很保守，大多与DNA结合域相连并形成一定的空间构象，如bZIP类转录因子的寡聚化位点包括1个拉链结构，而bHLH型转录因子含有螺旋-环-螺旋结构，MADS转录因子的寡聚化域则形成两个a-螺旋和两个β-折叠。这些寡聚化位点空间构象的变化产生了转录机制的多样性，从而使转录因子具有调控高等植物基因表达的能力。许多高等植物的转录因子形成异聚或同聚物，以影响DNA结合的特异性、转录因子对启动子元件的亲和和核的定位。
04
核定位信号（NuclearLocationSignal）
核定位信号是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位区域，转录因子进入细胞核的过程受该区段控制。不同植物转录因子核定位信号的序列、组织器官的分布和数量存在着差异。
图2转录因子调控逆境胁迫信号通路的典型模型。对于任何给定的非生物胁迫，激活信号传导级联的第一步是通过位于植物细胞膜上的受体/感应器识别胁迫信号，例如COLD1、OSCA1、MSLs、GLR、钙离子通道等。识别后，信号通过植物激素和第二信使，例如Ca2+和ROS（活性氧）等向下游传输信号。ROS会激活ROS调节的蛋白激酶（PKs）和蛋白磷酸酶（PPs），包括MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）级联、CDPKs（钙依赖性蛋白激酶）、CBLs（钙调神经磷酸酶B型蛋白）、CIPK（与CBL相互作用的蛋白激酶）、许多其他PKs，以及PP2Cs（蛋白磷酸酶2Cs）等PPs。随后，这些的PKs和PPs传递信息至下游并引发一系列的磷酸化/去磷酸化级联，尤其是转录因子的磷酸化/去磷酸化(Khanetal.,)。
表1转录因子参与调节植物对非生物胁迫的反应(Khanetal.,)。
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图3在非生物胁迫中转录因子二聚化模型。蛋白质通常会彼此建立组合相互作用，而不是单独发挥作用，以执行其复杂的生物学功能，转录因子通常会形成同源二聚体、异源二聚体或与其他蛋白相互作用(Khanetal.,)。
在本篇文章中，伯小远针对转录因子调控下游靶基因和信号通路——与DNA结合的特性，结合文献来进行实例说明。今后将陆续从其他角度来总结转录因子的研究方法。
下文出现的英文及解释：
基因名或蛋白名前的At指拟南芥，Gm指大豆，Mt指蒺藜苜蓿；
MtCBF4：本文主角；
MtCBF4OE：过表达MtCBF4基因的转基因株系；
R：蒺藜苜蓿野生种；
cbf4-1和cbf4-2：蒺藜苜蓿MtCBF4基因突变体；
MtCAS15：其他文献报道过的，与冷胁迫有关的基因；
MtMYB3：做实验找到的MtCBF4上游蛋白，其与MtCBF4基因的启动子元件存在相互作用；
MtMYB3OE：过表达MtMYB3基因的转基因株系；
myb3-1和myb3-2：蒺藜苜蓿MtMYB3基因突变体；
MtMYB61：做实验找到的与MtMYB3相互作用的转录因子；
myb61：蒺藜苜蓿MtMYB61基因突变体。
研究物种：
蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）
研究背景：
在蒺藜苜蓿中MtCBF4基因可由干旱、盐胁迫、冷胁迫诱导表达；在蒺藜苜蓿中瞬时表达MtCBF4基因能提高其耐盐能力；在拟南芥中异源过表达MtCBF4可以提高其耐旱、耐盐能力；在拟南芥中异源过表达GmDREB3（DREB即为CBF转录因子）能提高其耐冷、耐旱及耐盐能力。
在拟南芥中异源过表达两个MYB家族的转录因子GmMYB76和GmMYB可以提高其耐冷能力。
在紫花苜蓿中，冷胁迫可以诱导Ca2+的大量涌入，进而影响蛋白磷酸化及CAS15、CAS18基因的表达水平（CASgene：coldacclimation-specificgene，特异性耐冷基因）。
在拟南芥中，AtCBF3基因的表达可由转录因子ICE1诱导，并受转录因子MYB15的负向调控。
一句话总结
为研究MtCBF4基因产生的耐冷表型，作者及团队一步一步地找出与它相关的其他基因，并描述了其与上游转录因子MYB3/MYB61及下游基因MtCAS15发生的精彩故事。
做了哪些实验
01
研究MtCBF4基因的功能
——过表达与突变体株系分析
（1）过表达MtCBF4基因的转基因株系MtCBF4OE与野生型株系（WT）的比较：
——过表达载体构建及遗传转化、荧光定量PCR（qRT-PCR）（图5A）、Westernblot（图5B）、MtCBF4OE与WT的冷胁迫对比种植图（图4A、B）、不同温度下的冷胁迫存活率对比（图4C）、不同温度下的冷胁迫叶片电解质渗漏率对比（图4D）
实验结果：在过表达株系MtCBF4OE中筛选到了三个稳定的株系line1、line2、line3；这些株系的MtCBF4基因与野生型相比表达量显著升高；过表达载体中带有3*FLAG标签，因而使用anti-FLAG抗体确认了MtCBF4OE中MtCBF4蛋白的存在；与野生型相比，MtCBF4OE株系更加耐冷，其存活率增加、电解质渗漏率（表征细胞膜受损程度）降低。
（2）突变体cbf4与WT的比较：
——cbf4的鉴定（图5C）、cbf4与WT的冷胁迫对比种植图（图4E、F）、不同温度下的冷胁迫存活率对比（图4G）、不同温度下的冷胁迫叶片电解质渗漏率对比（图4H）
实验结果：突变体cbf4-1和cbf4-2的插入位点在CDS区域内部；与野生型相比，cbf4对冷胁迫更加敏感，其存活率降低、电解质渗漏率升高。
实验结论：MtCBF4基因正向调控耐冷信号。
图4过表达株系MtCBF4OE、突变体cbf4与WT的相关比较。
图5对过表达株系MtCBF4OE与突变体株系cbf4的相关鉴定。
02
研究MtCBF4基因的调控作用
——转录组测序（RNA-seq）（图6A）、qRT-PCR（图6B、C）
实验结果：与WT相比，RNA-seq结果表明，过表达株系MtCBF4OE中有个基因表达上调，63个基因表达下调；寻找前人文献中已发表的与耐冷有关的基因，使用qRT-PCR验证RNA-seq中的结果，这些耐冷基因显著上调表达，而在突变体中显著下调表达。
实验结论：CBF4调控与耐冷有关的基因表达，MtCBF4OE耐冷性的增加很可能是由于CBF4调控了耐冷基因的表达来实现的。
图6CBF4调节发育和环境相关的各种基因。
03
体外实验研究MtCBF4作用的靶基因
根据前人文献报道及作者团队的实验结果，MtCAS15是MtCBF4OE中最显著上调的基因之一，所以MtCBF4转录因子能否直接结合MtCAS15的启动子呢？
——凝胶电泳迁移实验（EMSA）（图7A）、染色质免疫沉淀（CHIP）（图7B）
实验结果及结论：在体外实验中，EMSA实验表明MtCBF4蛋白结合了MtCAS15基因的启动子顺式元件TACCGACAT；CHIP实验表明MtCBF4蛋白能够结合MtCAS15基因的启动子。
图7验证MtCBF4是否结合MtCAS15的启动子。
04
研究MtCBF4上游的蛋白
（1）寻找MtCBF4上游的蛋白
——启动子顺式元件分析、酵母单杂筛选顺式元件、酵母单杂筛库、酵母单杂点对点实验、亚细胞定位（图8A）、转录激活实验（图8B）
实验结果：为了研究MtCBF4基因是如何响应寒冷而被诱导的，分析其启动子序列，发现了9个MYB转录因子结合位点，经酵母单杂实验后仅发现TAGTTA这一个顺式元件不存在自激活现象，因而使用这一顺式元件筛库，得到15个候选蛋白，其中包含2个MYB转录因子，最后点对点实验确认其中的转录因子MtMYB3与MtCBF4基因的启动子元件存在相互作用。亚细胞定位实验显示转录因子MtMYB3定位于细胞核，并有转录活性。
图8转录因子MtMYB3的亚细胞定位及转录激活实验。
（2）体外实验确认MtMYB3与MtCBF4基因启动子的相互作用
——EMSA（图8A）、CHIP（图8B）
实验结论：MtMYB3可以在体外特异性结合MtCBF4基因的启动子。
图8验证MtMYB3是否结合MtCBF4的启动子。
05
对调控MtCBF4的转录因子MtMYB3进行研究，
研究MtMYB3基因的功能
——过表达与突变体株系分析
（1）过表达MtMYB3基因的转基因株系MtMYB3OE与WT的比较：
——过表达载体构建及遗传转化、qRT-PCR、Westernblot、MtMYB3OE与WT的冷胁迫对比种植图（图10A、B）、不同温度下的冷胁迫存活率对比（图10C）、不同温度下的冷胁迫叶片电解质渗漏率对比（图10D）
（2）突变体myb3与WT的比较：
——myb3的鉴定、myb3与WT的冷胁迫对比种植图（图9E、F）、不同温度下的冷胁迫存活率对比（图10G）、不同温度下的冷胁迫叶片电解质渗漏率对比（图10H）
（3）对MtMYB3OE与myb3中CBF和CAS基因的表达量分析：
——qRT-PCR（图11A、B）
实验结论：MtMYB3基因负向调控耐冷信号；MtMYB3负向调控MtCBF4/MtCAS15。
图10过表达株系MtCBF4OE、突变体myb3与WT的相关比较。
图11MtMYB3下调MtCBF4的表达。
06
对调控MtCBF4的转录因子MtMYB3进行研究，
寻找MtMYB3上游的蛋白
——酵母双杂筛库、亚细胞定位、转录激活实验、GSTpulldown、BiFC
实验结果：使用MtMYB3作为诱饵进行酵母双杂筛库实验，筛出与其相互作用的蛋白——另一个MYB转录因子MtMYB61，亚细胞定位显示其定位于细胞核并具有转录激活活性。酵母双杂实验显示只有当MtMYB3与MtMYB61同时存在时才能激活报告基因的表达（图12A），GSTpulldown（图12B）和BiFC（图12D）实验证实了MtMYB3和MtMYB61之间的相互作用，MtMYB61与MtMYB3N端的DNA结合结构域相互作用，但不与其C端区域相互作用（图12C）。
图12MtMYB3与MtMYB61的相互作用。
07
对调控MtCBF4的转录因子MtMYB3进行研究，
寻找到与MtMYB3相互作用的蛋白MtMYB61，研究MtMYB61基因的功能——过表达与突变体株系分析
（1）过表达MtMYB61基因的转基因株系MtMYB61OE与WT的比较：
——过表达载体构建及遗传转化、qRT-PCR、Westernblot、MtMYB61OE与WT的冷胁迫对比种植图（图13A、B）、不同温度下的冷胁迫存活率对比（图13C）、不同温度下的冷胁迫叶片电解质渗漏率对比（图13D）
（2）突变体myb61与WT的比较：
——myb61的鉴定、myb61与WT的冷胁迫对比种植图（图12E、F）、不同温度下的冷胁迫存活率对比（图13G）、不同温度下的冷胁迫叶片电解质渗漏率对比（图13H）
（3）对MtMYB61OE与myb61中CBF和CAS基因的表达量分析：
——qRT-PCR（图14A、B）
实验结论：MtMYB61基因正向调控耐冷信号；MtMYB61与MtMYB3的功能相反。
图13过表达株系MtMYB61OE、突变体myb61与WT的相关比较。
图14MtMYB61上调MtCBF4的表达。
08
对调控MtCBF4的转录因子MtMYB3进行研究，
寻找到与MtMYB3相互作用的蛋白MtMYB61，如何研究MtMYB61与MtCBF4的关系？
（1）MtMYB61是否对MtCBF4基因有调控作用？
——EMSA（图15A）
实验结果：EMSA实验显示MtMYB61不结合MtCBF4基因启动子的任何顺式元件。
（2）根据上述所有的实验结果，推测MtMYB61可能抑制MtMYB3结合MtCBF4基因启动子的能力，如何验证这个推论呢？
——双荧光素酶实验（图15B、C）
实验结果：MtMYB61无法调控MtCBF4的表达；MtMYB3降低了MtCBF4的表达，进一步表明该TF的负转录功能；在MtMYB61存在的情况下，MtMYB3对MtCBF4基因的负向调控得以部分缓解。
实验结论：MtMYB61能够抑制MtMYB3对MtCBF4表达的负向调控。
图15MtMYB61抑制MtMYB3结合MtCBF4基因启动子的能力。
09
对所有基因MtMYB61，
MtMYB3，MtCBF4和MtCAS15之间关系的研究
——qRT-PCR（图16A）、CHIP（图16B）
实验结果：MtMYB61基因在冷胁迫后被迅速而强烈地诱导，1h时达到顶峰；MtCBF4也对冷胁迫反应强烈，但反应较慢，2.5至3.5h达到顶峰；MtCAS15在12至24h被强烈的诱导；在CHIP实验中，与WT相比，myb61突变体中F2R2和F3R3区域的富集程度更高。
实验结论：MtMYB61能够抑制MtMYB3结合MtCBF4的启动子。
图16MtMYB61减轻了蒺藜苜蓿在冷胁迫时MtMYB3对MtCBF4的抑制作用。
10
预测信号通路：
该项研究确定了一种豆科植物冷胁迫相关的MYB/CBF信号通路，在非胁迫条件下，MtMYB3与MtCBF4启动子结合抑制其表达。发生冷胁迫后，MtMYB61迅速转录，MtMYB61与MtMYB3相互作用，从而减轻MtMYB3对MtCBF4的转录抑制，MtCBF4的表达迅速增强，MtCBF4的积累导致冷胁迫基因（如MtCAS15）的直接转录激活，并最终提高了植物的抗冻性。但MtMYB61如何被诱导转录还需继续研究。
图17预测的冷胁迫相关的MYB/CBF信号通路模型。
研究模式总结
图18基因组学中涉及植物防御的转录因子的功能研究模式图。
今后伯小远将陆续解读转录因子系列文献，会继续补充该模式图，所以大家别忘了
