北京知名雀斑医院 http://news.39.net/bjzkhbzy/210824/9355962.html可能很多老师在分析数据的时候都有想过，流式图该把门圈在哪里才比较靠谱？尤其是那些分群不明显的结果，画门位置就是最大的苦恼。做流式我们知道几种常见的对照：1.空白对照（未染色细胞）；2.单阳对照；3.同型对照；4.FMO对照；5.生物对照。了解这几种对照的正确用法基本可以使流式数据的分析更客观更准确。接下来罗工就和大家聊聊这几种对照的用法。
空白对照
作用：作为电压调节的参考，上机调电压的时候先要用空白管上机，调整电压参数使细胞信号在图上各个通道的合适位置；同时也是可以看到细胞的本底信号，圈门时直接排除。
但我们有时候会发现，常规的未染色管（空白对照）似乎不足以帮助我们确定圈门位置，如下图案例展示。这是什么原因呢？
首先，图上空白是未经药物处理的空白细胞，但是高浓度药物很可能会增加细胞的本底荧光信号，如果还按照未处理细胞圈门，可以从分群情况明显看到门不太适用于该样本。这种情况就要注意空白细胞的选择要合适，最好是与实验组经过相同处理的细胞，比如做了固定破膜、加了药物处理等，也就是除了不加抗体，其他处理都一致，这样本底信号的排除才更加准确。
单阳对照
单阳对照，也就是单染对照。
作用：做单染调补偿是其主要作用，也可以协同调电压，防止阳性信号超出接收范围。
单阳对照，很多老师都有疑惑，我们现在把问题一一罗列出来。
1.做单染的细胞如何选择，可以混合细胞做吗？
2.单染阴性阳性信号分不开？
3.做单染的细胞数量不够？
4.单染调完补偿应用到样本上不适合？
解决上述问题我们首先要了解做单阳管的基本原则。
单阳细胞阴阳群背景信号要一致，不能混合细胞做单阳；
单阳信号要要阴阳分群明显，足以判断补偿是否合适；
单阳染的荧光抗体，荧光要跟样本一致，不能用同通道其他荧光代替；
单阳收集记录的events数要足够，避免因数据太少导致补偿计算差异太大。
因此，单阳可以用细胞，也可以用补偿微球（详情参看罗工秘籍42），但是不能混合在一管染，细胞也最好是跟样本接近的类型，不要两种相差很大的细胞混合在一起做（如药物处理和未处理的细胞混合做单阳）;如果细胞单染阳性分群不明显，可以选择相同荧光素的高表达marker抗体染细胞（如foxp3/AF用CD8/AF抗体代替做单染），也可以用补偿微球代替细胞做单染；收集记录的单阳数据至少要以上，确保后续补偿值计算的准确性。
同型对照
作为排除背景荧光的对照，试用同型对照可以更准确的排除假阳性，也能帮助验证抗体的特异性。
作用：1.看荧光染料与细胞的结合问题；2.看抗体FC段与与细胞FCR的结合；3.看抗体与细胞的其他非特异结合。
举个例子：参考空白圈的会有部分非特异染色，参考同型圈阳性，就把这部分非特异排除了。
很多验证抗体的特异性也会用同型做QC，比如BD
