细胞增殖检测法EdU染色实验 [复制链接]

原理：Edu，中文名称（5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷），是胸腺嘧啶核苷类似物。在细胞增殖过程中，Edu会被摄取到细胞核中，与DNA合成过程中的脱氧核糖核酸（DNA）结合，形成Edu-DNA复合物。这个复合物可以被抗Edu抗体识别和结合，从而形成Edu-DNA﹣抗体复合物。通过检测这个复合物的信号强度，可以确定细胞增殖的速率和细胞周期。

实验步骤：

一、荧光成像法

1、取对数生长期细胞，接种于96孔板中2、标记细胞①制备EdU培养基②加入EdU培养基孵育，弃培养基③PBS清洗细胞3、固定细胞①加入细胞固定液（预冷的4％多聚甲醛）室温孵育30分钟，弃固定液②加入甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液③加入PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS④加入渗透剂（TritonX-的PBS）脱色摇床孵育10分钟，PBS清洗4、染色Apollo染色①加入Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液②加入渗透剂（0.5%TritonX-的PBS）脱色摇床清洗2~3次，每次10分钟，弃渗透剂③加入甲醇清洗1~2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟DNA染色①制备适量Hoechst反应液，避光保存②避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液③加入PBS清洗1~3次5、图像获取及分析

二、流式细胞仪法

1、取对数生长期细胞，接种于6孔板中2、标记细胞①制备EdU培养基，设置1个不加EdU培养基的对照组②加入EdU培养基孵育，弃培养基③PBS清洗细胞3、固定细胞①将细胞收集至流式管中，离心，用枪头吸弃上清；②4％多聚甲醛固定15~30min后，离心，用枪头吸弃上清；③加入甘氨酸中和5min，离心，吸弃上清，PBS清洗1次，离心，吸弃上清④加入渗透剂（0.5%TritonX-的PBS）室温孵育10min，离心，吸弃上清，PBS清洗1次，吸弃上清4、染色Apollo染色①加入Apollo染色反应液，避光、室温孵育10分钟后离心，吸弃染色反应液②加入渗透剂（0.5%TritonX-的PBS）室温清洗2~3次，离心吸弃上清，加PBS重悬5、图像获取及分析

EdU实验常见问题：

1、什么样的信号才是真正的EdU阳性信号？①Apollo染色信号与核染色信号完全重合，或者与核重合的信号明显强于胞浆上的信号（染料附着等）②一般部分细胞上的信号呈现上述特征，而不是全部细胞。

2、整个细胞都有EdU信号，或背景信号很强。①染色后洗涤不充分。②染色过程中干片，导致染料粘附严重。③多聚甲醛固定时间过长而未使用甘氨酸中和。④没有阳性信号而曝光过度导致背景严重。

3、没有阳性信号。①EdU处理时间太短导致没有阳性信号。②染色过程干片等因素导致未染上信号。③对于阴性结果，可设置阳性对照以确认染色过程无误。

4、细胞中表达有GFP，Apollo染色后检测不到GFP的荧光信号。Apollo染料会造成GFP的失活，故Apollo染色后无法直接检测GFP。

通过Edu细胞增殖实验，可以定量测定细胞增殖速率和细胞周期，还可以研究细胞分化和细胞凋亡等生物学问题。Edu细胞增殖实验具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，因此被广泛应用于生物学研究和药物筛选等领域。