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在含有药物的细菌培养基温育的过程中,松弛 [复制链接]

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氯霉素抑制蛋白质的合成并且阻碍宿主DNA合成,但对松弛型质粒的复制没有影响。因此,在含有药物的细菌培养基温育的过程中,松弛型质粒的拷贝数增加。

直到20世纪80年代初,大量培养时经常使用氯霉素以获得可观的含有野生型colE1复制子的质粒。年后,大多数构建的高拷贝数质粒载体携带突变,将质粒DNA从拷贝数控制解除。

含有这些突变版本的colE1起始点的载体维持在每个细胞数百个拷贝,即使不抑制细菌蛋白质的合成也可以得到高产量的质粒DNA。然而,用氯霉素处理细菌培养物仍具有一定的优势:在药物的存在下,质粒的拷贝数可以进步增加2~3倍,更重要的是,细菌裂解液的体积和黏度都大大降低,因为宿主的复制受到抑制。

许多研究者发现,在生长培养中添加氯霉素比处理高黏稠的裂解液方便得多。衔接子是短的双链合成寡核苷酸,在一端或两端携带限制性内切核酸酶识别位点和单链尾巴。它们可用于将研究者选择的限制位点添加到一个现有的限制位点上。

衔接子的单链尾巴连接到限制性切割靶DNA所产生的匹配的突出单链末端。连接后,靶DNA的新末端序列可以用适当的限制性内切核酸酶切割,以产生新的突出末端。衔接子的鼎盛时期在前PCR时代。

如今,在DNA末端添加给定序列的方法是简单地将识别序列掺入到PCR寡核苷酸引物5端中(见方案9)。但是,如果靶DNA群体由不同序列组成(如cDNA群体或基因组DNA片段集合),衔接子是一一个有吸引力的选择。

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