多细胞生物中，调节性细胞死亡过程(RCD)是细胞维持组织形态和功能必不可少的稳态机制。此前研究较多的调节性细胞死亡包括三大类：细胞凋亡、自噬和坏死。
“铁死亡”这一概念最早在年由Dr.BrentRStockwell提出，它是一种铁离子依赖的新型细胞调节性死亡，在细胞形态学上，生化特征区别于细胞凋亡、坏死、自噬。从机制上简单来说，铁死亡是细胞膜上铁依赖性的高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，诱导的细胞死亡。
近年来，铁死亡相关研究是如火如荼，前途一片光明。今年1月，广州医科大学唐道林教授团队在NatRevClinOncol上发表题为Broadeninghorizons:theroleofferroptosisincancer的综述。
图1.铁死亡在癌症中的作用[1]
在这篇高分综述中，关于铁死亡，作者提出了几个观点：
1、铁死亡(Ferroptosis)是一种调节性的细胞死亡，依赖于铁介导的氧化损伤。
2、铁死亡可以通过两条主要途径：外源性(转运蛋白依赖)途径，内源性(酶调控)途径。
3、铁积累的增加，自由基的产生，脂肪酸供应与脂质过氧化物增加是诱导铁死亡的关键。
铁死亡的主要途径
■外源性(转运蛋白依赖)途径
外源性途径是通过抑制细胞膜转运蛋白如胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白(Systemxc-)，或激活铁转运蛋白血清转铁蛋白和乳转铁蛋白启动的。
1、抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白来促进铁死亡
Systemxc-是细胞内重要的抗氧化体系，该系统由2个亚基组成，SLC7A11和SLC3A2。SLC7A11负责主要的转运活性，对胱氨酸和谷氨酸有高度特异性，而SLC3A2则作为伴侣蛋白。Systemxc-以1:1的比例用胞内谷氨酸来换取胞外的胱氨酸(Cys2)，胱氨酸在谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)和谷胱甘肽合成酶(GSS)的催化作用下合成谷胱甘肽(GSH)。
GSH是膜脂修复酶——谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)的还原性辅因子。抑制Systemxc-的活性会抑制胱氨酸的吸收，影响GSH的合成，继而导致膜脂修复酶GPX4活性降低，细胞抗氧化能力降低，从而促进铁死亡。
2、铁转运蛋白与铁“超载”
增加铁的吸收，减少铁的储存和限制铁的外流都会导致铁积累增加，然后通过一系列的信号传导途径来促进铁死亡。
转铁蛋白(血清转铁蛋白或乳铁蛋白)通过转铁蛋白受体(TFRC)介导铁摄取，FTH1/FTL(铁蛋白组件)通过自噬降解可以增加铁的水平，这些都可以促进铁死亡。而SLC40A1介导的铁外流和外泌体介导的铁蛋白输出会抑制铁死亡。
(红色框：GSH-GPX4抗氧化系统在铁死亡途径中起重要作用；亡；绿色框：脂肪酸积累与铁死亡调控；紫色框：甲羟戊酸(MVA)途径抑制GPX4的合成。)
■内源性(酶调控)途径
内源性途径是通过阻断细胞内抗氧化酶(如GPX4)激活的。
1、抑制GPX4诱导铁死亡
脂质过氧化物积累是铁死亡的标志。GPX4可将细胞*性脂质过氧化物(L-OOH)还原为相应的醇(L-OH)，抑制GPX4活性会导致细胞膜脂质过氧化物的积累。
直接抑制：如RSL3作为铁死亡诱导剂，可直接作用于GPX4并抑制其活性，因此降低了细胞的抗氧化能力并积累了ROS，从而导致铁死亡。
间接抑制：前面提到的抑制GSH的合成；硒代半胱氨酸是GPX4活性基团的必需氨基酸之一，抑制甲羟戊酸途径可下调硒代半胱氨酸tRNA的成熟来影响GPX4的合成，从而影响GPX4的活性并诱导铁死亡。
2、其他酶的调节途径与脂肪酸积累
乙酰辅酶A羧化酶(ACAC)介导的脂肪酸合成，脂质吞噬(Lipophagy)介导的脂肪酸释放，可诱导细胞内游离脂肪酸的积累，促进铁死亡。
长链脂肪酸辅酶A连接酶4(ACSL4)和溶血磷脂酰基转移酶3(LPCAT3)促进多不饱和脂肪酸(PUFA)掺入磷脂中形成多不饱和脂肪酸的磷脂(PUFA-PL)。PUFA-PLs易受脂氧合酶(ALOXs)介导的自由基引发的氧化作用。这种氧化作用最终会导致脂质双层的破坏并影响膜功能，从而促进铁死亡。
铁死亡的研究策略
上文介绍了铁死亡的基本途径。铁死亡有哪些研究策略呢？下面以文献Energy-stress-mediatedAMPKactivationinhibitsferroptosis为例。
作者团队建立了特定病理过程(铁死亡)的细胞模型，使用多种诱导剂和抑制剂，以及多种检测方法证明铁死亡与AMPK的调控关系，并建立了AMPKα1/α2的基因敲除细胞系(AMPKDKO)，验证AMPK缺失对铁死亡敏感性的作用机制。
■确立铁死亡病理模型
1、能量应激(Energystress)抑制铁死亡
首先，研究人员探索了永生化小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中，葡萄糖饥饿条件对Erastin诱导的铁死亡的影响。首先，证明Erastin诱导铁死亡：Caspase-3或PARP裂解均未下调(细胞凋亡的标志)，而且铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可以逆转Erastin诱导的细胞死亡。最初他们预想，葡萄糖饥饿的条件会增强Erastin诱导的铁死亡，结果恰恰相反：葡萄糖饥饿很大程度上逆转了MEFs中引起的铁死亡。
图3.能量应激抑制铁死亡
(a.Erastin诱导MEFs铁死亡；b.葡萄糖饥c-d.CCK8法和脂质过氧化测定法检测不、A。这些化合物也显著抑制了由Erastin处理引起的脂质过氧化和铁死亡。综上所述，能量应激抑制了铁死亡。
2、AMPKα1/α2的基因敲除细胞系建立
上述模拟或诱导能量应激的化合物均会激活AMPK，那么AMPK是否参与能量应激介导的铁死亡抑制？MEFs中，如图4a-b，AMPK双敲除(DKO)可以完全逆转诱导能量应激的化合物对Erastin诱导的铁死亡的抑制作用。
紧接着，如图4c，作者又验证了一组细胞系中的基础AMPK激活状态(p-AMPKThr为激活标志)与铁死亡(SLC7A11的表达水平)相关性。并且如图4c-d所示，SLC7A11高表达细胞相对于低表达细胞对铁死亡的抵抗力更高，值得注意的是，虽然在SLC7A11高表达细胞中AMPK激活状态与铁死亡的敏感性无关，但SLC7A11低表达细胞中AMPK的激活与铁死亡敏感性呈负相关。以上数据表明能量应激部分通过AMPK抑制了铁死亡。图4.能量应激抑制铁死亡与AMPK相关(a.AMPKα1/α2双敲除细胞系的建立；b.不同能量应激条件下AMPKDKO细胞对铁死亡的响应；c.不同细胞系的AMPK激活与SLC7A11的基础表达水平；d.通过CCK8法和脂质过氧化测定法检测，SLC7A11表达与细胞对铁死亡的敏感度相关。)3、AMPK失活使癌细胞对铁死亡敏感
AMPK在高基础AMPK磷酸化水平的癌细胞系中是否会促进铁死亡抗性？AMPK抑制剂CompoundC可下调AMPK的激活，如图5a-b，CompoundC处理使ACHN细胞(高基础AMPK磷酸化的抗铁碱化细胞系)对Erastin或胱氨酸耗竭变敏感。透射电子显微镜(TEM)的结果也显示，ACHN细胞中，CompoundC与Erastin或胱氨酸耗竭共同处理导致线粒体收缩，膜密度增加，但细胞核中没有明显的DNA片段化(铁死亡的细胞特征形态特征)。这表明AMPK的抑制使癌细胞对铁死亡敏感。
图5.Erastin或胱氨酸耗竭条件下ACHN细胞对铁死亡的敏感性(a-b.CCK8法和脂质过氧化测定法检测，Erastin或胱氨酸耗竭条件下ACHN细胞对铁死亡的敏感性；c.透射电子显微镜(TEM)分析)综上所述，能量应激对铁死亡的抑制作用，并且这种抑制作用部分是通过AMPK的激活实现的。
总结：
1、GSH-GPX4抗氧化系统在铁死亡途径中起重要作用。脂质过氧化物增加，转铁蛋白等介导的铁的积累，以及细胞内游离脂肪酸的积累都可以诱导铁死亡。
2、HyeminLee等人使用铁死亡通路相关的抑制剂/诱导剂，以及建立了AMPK敲除细胞系，证明铁死亡与AMPK之间的调节关系。
3、常见的检测铁死亡的实验方法：铁死亡相关细胞存活分析，如文中的CCK8法(其他细胞活力检测方法还包括MTT法，台盼蓝染色等)。
4、除了细胞活力测定，脂质氧化水平的测定(文中的C11BODIPY/染色)，GSH测定，线粒体ROS测定，以及GPX4活性测定，电镜下线粒体的变化的监测，特异性靶标分子的分析(WB、IHC、IF等)也是常用的检测手段。
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缩写RCD:RegulatedcelldeathSystemxc-
hecystine/glutamatetransporterACAC:Acetyl-CoAcarboxylaseACSL4：Acid-CoAligase4GSH:GlutathioneGCL:Glutamate-cysteineligaseGSS:GlutathionesynthetaseCys2：CystineGPX4:GlutathioneperoxidaseTFRC:Iron-loadedserotransferrin-transferrinreceptorFTH1/FTL:Ferritin
