在当今很多广泛应用的染色技术中，有的功能单一，特异性好，却因试剂需求过偏，实用性大打折扣；
也有的既实用又高效，却也难于在本身上衍生出新的技术突破；
然而还有着这样一些在操作上看似平常无奇，而在功能上却又出类拔萃的染色技术，其中就不乏免疫荧光多重染色(以下简称IF多染)。
图：大鼠海马组织（光谱拆分结果）
多染VS单染
谈到IF多染，就不得不提起IF单染，相比起IF单染，IF多染并不是多么复杂多变，其实，IF多染很多方面都与IF单染相同。
在原理上，IF多染依旧是利用带有荧光基团的一抗/二抗与抗原直接/间接的结合，再通过荧光显微镜镜检。
IF多染的变化仅仅是在IF单染的抗体配置步骤上多出了等体积混合不同的一抗与等体积混合不同的二抗两个步骤，即一抗A与一体B的工作液等体积混合，二抗C与二抗D的工作液等体积混合。
那么，问题就来了——
多重免疫荧光染色技术岂不是与单染一样简单?
当然不是!
通常在进行IF单染前，需要在一抗、二抗抗体的种属来源、适用实验、反应物种、特异性、标记方式、抗体结构这几方面仔细阅读，而进行IF多染的前提条件是使用的各一抗种属来源不能相同;也正是基于这样一个必要条件，在面临琳琅满目的一抗/二抗之间的选择时，IF多染实验有更苛刻的限制;不仅除了前面所列的一抗、二抗选择要素外，还要特地针对二抗进行仔细、认真的选择。
一般来说，多重免疫荧光染色实验中二抗的选择条件比较多：
1，要使用间接标记的荧光抗体
1)应用范围广;
2)直接标记的一抗经过纯化后标记，拥有干净的背景，适用于多染，但在IF多染实验的实际应用中很有限，且身披不菲的价格，对个人的实验条件有一定限制。
2，二抗种属来源需相同
这是为防止不同种属来源的二抗发生交叉反应以及生成较高的背景——若一抗A、B种属分别为Rat、Rabbit，那么二抗的种属必须为donkeyanti-Rat、donkeyanti-Rabbit或goatanti-Rat、goatanti-Rabbit等。
3，要选择预吸附的二抗
普通荧光二抗有可能与内源性的免疫球蛋白发生相互作用，而预吸附的二抗则可以降低这种情况的发生，从而提供很低的背景。
4，二抗荧光颜色尽量差异大
若选用荧光相近的粉色和粉红或青绿和绿色则很有可能面临拍出来的图片存在串色的问题，虽然能通过激光共聚焦显微镜的各通道分辨各荧光染料的颜色，但是拍出来的合成图将会给图像分析带来一定的麻烦。
由此看来，多重免疫荧光染色实验没那么简单，但是也并没想象中的那么复杂，它只是将IF单染的各项功能实现了最大，所以虽然单染看似一门平常的实验，而它衍生出的多染则有着它耐人寻味的一面。
并且，只要你掌握了这么实验技术，4-10分的论文信手拈来！不信，你看——
案例文章1：JTRANSLMED)，IF=4.分
作者将多标技术作为切入点，与传统免疫组化检测相比，在同一组织中CD8、FOPX3、PD-L1这3个靶点的表达部位一致。而通过多标检测，可以分析3个靶点间的空间和相互作用关系，为其在该疾病中的功能提供更有价值的信息。
案例文章2：taylorfrancis，IF=5分
作者利用多重荧光免疫组织化学(FIHC)和靶向基因表达谱分析(nanoStringpan-cancerimmunologypanel)，分别从蛋白质和RNA水平分析了免疫特征与TGCT预后的关系，提示这些免疫特征可能具有的预后意义。
就这样简简单单，一篇IF=5.5分的论文就出来了。
Opal-TSA多标记免疫组化——同一切片实现多达7种生物标记染色！
一直以来，多标记免疫组化染色貌似就存在诸多困难，例如抗体种属交叉反应、多轮处理后的标签稳定性、高低信号之间的平衡以及弱表达标记物的检测等。因而在FFPE组织或冷冻切片中检测三种或更多生物标记物成为限制研究者的一大障碍。
而巴菲尔的Opal是利用TSA技术开发的多标记复染方案，利用TSA信号不受微波影响，并能在抗体去除后保留信号的原理。可以为组织样品特别是FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)样品进行染色，并且允许在同一样本中使用同一种属来源的不同一抗进行多标记识别，轻松实现多重免疫荧光染色！
巴菲尔Opal独特优势：
◆同一切片实现多达7种生物标记染色(含核染)
◆检测灵敏度较普通IHC提高近倍
◆可使用同一种属来源的一抗，且无干扰
◆降低一抗使用量从而节约成本
◆微波去除一抗/二抗干扰
◆洗脱去非特异性染色
可适用的研究方向：
●肿瘤浸润性淋巴细胞检测;
●实体瘤免疫检测;
●免疫学研究;
●淋巴细胞检测。
另外，巴菲尔还是多光谱组织成像技术华中地区独家合作实验室，只要你有idea，Biofavor超全的实验技术+严谨的科学态度，让你发paper分分钟搞定!
利用多重免疫荧光染色实验，轻轻松松发4-10分论文的技巧，你get到了没？
生物女学霸，一个自称学霸其实很渣的生物汪，努力将有趣的、有用的、有血有肉的科研那些事儿呈现给大家，
