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#结构生物学与冷冻电镜#
遗传信息的翻译(Translation)是所有细胞内最基本的功能。核糖体(Ribosome)及核糖体翻译中间体的结构解析对于深入理解蛋白质合成过程至关重要。传统的结构生物学方法大多需要纯化的样品，因而要破坏完整的细胞结构；这不仅意味着细胞内环境的丢失，更会破坏生物大分子在细胞内的三维空间分布。近年来，以冷冻电镜断层成像技术(Cryo-electrontomography,cryo-ET)和亚断层结构平均(Sub-tomogramaveraging)为代表的的原位结构生物学方法(insitustructuralbiology)展现出在细胞内直接解析生物大分子结构的潜力，代表着结构生物学的未来发展方向。然而，大多数cryo-ET结构一直停留在纳米级分辨率水平,降低了其解析细胞内分子机器精细结构的可能性。
年9月28日，欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory,EMBL)的JuliaMahamid课题组在Nature发表了题为Visualizingtranslationdynamicsatatomicdetailinsideabacterialcell的研究论文。该研究利用cryo-ET及新开发的亚断层结构分析(Sub-tomogramanalysis)方法，在极高分辨率水平(3.5)上首次解析了肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)细胞内翻译延伸全过程的结构基础，以及不同抗生素对细胞内翻译过程的影响。
首先，该研究利用肺炎支原体作为已知最小的细胞，在不进行样品减薄的情况下收集了大量高质量的cryo-ET数据。使用该课题组之前搭建的基于Warp/M与RELION的cryo-ET数据处理流程，该文作者首次在正常细胞内将核糖体整体分辨率推进到3.5(图1)。基于此构建的首个肺炎支原体核糖体原子结构模型揭示了新的核糖体蛋白(ribosomalproteins)结构，显示出核糖体在不同细菌细胞内的结构多样性。
图1
Cryo-ET直接在细胞内解析核糖体高分辨率结构
随后，该研究对从正常细胞tomogram中提取的核糖体颗粒(~ksub-tomograms)进行了系统的三维结构分类，并最终得到了13种处于不同翻译状态的核糖体中间体结构。其中10种主要结构可以组成一个包括进位解码，肽键形成与tRNA移位等分步骤的完整的翻译延伸循环(图2)，近乎连续地捕捉到了核糖体大小亚基间，小亚基内与L1stalk的构象变化，以及延伸因子EF-Tu，EF-G与tRNA的位置变化。此结果不仅证明了若干翻译中间体在细胞内的存在，也揭示出不同的翻译中间体可能组成多样的反应路径。通过统计不同结构状态下核糖体颗粒的分布数据，该研究提供了一探细胞内的翻译分子机器功能图谱(energylandscape)的可能。有趣的是，本文观测的个细胞表现出非常相似的状态分布(图2,untreatedcells)。这表明稳定的核糖体翻译状态分布可能是细胞内稳态的一个重要指征。
图2
三维颗粒分类解析细胞内核糖体翻译延伸循环
为了探究不同细胞状态下核糖体的结构功能变化，该研究使用了3种不同的抗生素来处理细胞。其中，特异性结合于核糖体的氯霉素(Chloramphenicol,Cm)与奇霉素(Spectinomycin,Spc)分子将大多数核糖体锁定在特定的翻译中间体状态，并且可以直接看到相应的药物分子密度。但是，即使在很高的抗生素浓度下，依然有少部分核糖体处于不能被已知的抗生素作用机制所解释的中间体状态。另外，特异性结合于RNA聚合酶的新型抗生素Pseudouridimycin(PUM)不直接影响核糖体功能，但经PUM处理过的细胞也表现出完全不同于正常细胞的核糖体状态分布。以上结果表明不同的抗生素导致肺炎支原体细胞表现出不同的核糖体状态分布。在细胞水平上探究分子机器的功能状态变化有助于更深入地理解抗生素的作用机制。
图3
抗生素影响细胞内核糖体功能状态分布
最后，该研究将处于不同功能状态的核糖体重新投射回细胞内，进而得到一个详细而精确的核糖体三维空间分布图(图4a,structuralandfunctionallandscape)。在同一条mRNA上翻译延伸的多个核糖体会在空间上相互靠近并形成具有不同拓扑结构的多聚核糖体(图4b)。在空间位置非常接近的情况下，持续行进中的多个核糖体间如何协调是该研究领域的一个核心问题。该文作者发现，当两个核糖体过于接近时，前面的核糖体会影响翻译延伸因子，尤其是EF-G，结合到后面的核糖体上。这种机制可以暂时性地将后面的核糖体’锁定’,从而避免处于行进中的两个核糖体直接相撞。他们进一步揭示了这一机制的结构基础：在紧密排列的多聚核糖体中，前一个核糖体上的核糖体蛋白L9可以通过改变构象的方式将其C末端伸展到下一个核糖体的延伸因子结合位点，从而干扰其延伸因子结合(图4c)。
综上，该研究突破了细胞内结构解析的分辨率极限，全面展示了肺炎支原体细胞内翻译过程相关的分子景观(molecularlandscape)及其动态变化。其在方法学上的诸多探索为今后实现高分辨率的细胞结构生物学打下了基础。
图4
细胞内核糖体与多聚核糖体的三维空间组织关系
欧洲分子生物学实验室JuliaMahamid组博士后薛亮为该研究第一作者。柏林工业大学JuriRappsilber，马普所PatrickCramer，以及EMBLPeerBork和MariaZimmermann课题组成员也参与了该研究。值得一提的是，近年来该文作者与合作者一道利用肺炎支原体为细胞模型发表了一系列cryo-ET文章，扩展了cryo-ET与原位结构研究的边界，为我们勾勒出一幅未来细胞结构生物学的发展图景。
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