活细胞是生物技术的核心，用于生产和测试生物药物的细胞系也是非常宝贵的资产。细胞库建立的过程通常从科学家感兴趣的细胞克隆的研究细胞库(researchcellbank，RCB)的开发，到建立主细胞库(mastercellbank，MCB)，之后从主细胞库中就可以产生工作细胞库(workingcellbanks，WCB)。特别是对于生物技术初创公司，MCB的准备可能涉及从标准实验室条件下执行的工作过渡到符合GMP规范操作的重大转变。MCB还必须经过严格的表征测试，以确保从这些库中生长的细胞的纯度、安全性、功能性和遗传稳定性。出于这样的原因，哪些必要过程可以将细胞库从最早的研究状态过渡到能够实现生物药GMP生产中？在什么条件下与您签约的合作伙伴会选择细胞系进行建库准备和测试？应该在什么条件下准备、储存和最终处理好的细胞库？生产结束(EndOfProduction，EoP)细胞库（EOPB）要经过哪些类型的测试？由于监管体系和水平的日益完善和提高，这些问题一直是生物药企业和专业人员所关心的问题，要求我们深入探索细胞库本身的重要性，而不是让这个话题偶尔作为研发和生产人员的档案。在这篇文章中，我们分享了我们从生物制药研发企业、CDMO、学术研究人员和行业咨询机构那里收集到的一些有关细胞库的人们所关心的问题进行讨论和分享。细胞库表征基础知识生物制品企业一般什么时候准备和表征MCB和WCB，细胞库需要哪些类型的检测？RCB可用于临床前工作，但首次人体(firstinhuman，FiH)研究通常作为开发符合GMP指南的MCB的始发点。WCB通常是在候选药物建立了有效的药效证明，并启动1期临床试验中的其他研究后建立生产的。因为符合GMP的MCB是制造临床级原料药和启动临床研究的关键步骤的一部分，应该鼓励客户在细胞单克隆筛选后尽快建立MCB。在准备和表征MCB的同时，开发工作可以同时进行。由于初始甚至后续的GMP生产不需要WCB，因此可以推迟WCB的准备和测试。MCB需要进行彻底的分析和测试。其中一些测试确定细胞库是无菌的并且没有病*和微生物（例如支原体、细菌和真菌）污染。其他化验需要确保储存的细胞在遗传上是稳定的，并且具有产生特定产品的必要条件。与MCB相比，WCB监管机构是接受经过简化的测试，但ICHQ5A(R1)要求每个WCB使用体外细胞年龄极限（thelimitofinvitrocellage，LIVCA，体外细胞代次限度试验也称为EoP细胞和培养极限测试）进行一个循环分析。在整个生产过程中培养细胞，然后收获并评估潜在的、应激诱导的病*。EoP测试与MCB表征一样严格。国际人用药物技术要求协调委员会(ICH)的质量指南推动了细胞库测试，特别是ICHQ5A(R1)、Q5B和Q5D。在美国，研究人员还可以参考FDA在年制定的重点考虑文件（用于生产生物制品的细胞系表征中需要考虑的要点）。这些文件和指南提供了所需测试的详细说明。由于不同的生物体含有不同的病*，因此监管指南规定了特定细胞系所需的检测方法。从逻辑上讲，生物药开发人员可以在内部进行一些必要的检测，包括对生长和生产动力学、产品滴度和产量的评估。但表征分析主要是由第三方进行测试和处理。当细胞库出现问题时，什么细胞库条件最难满足？根据我们的经验，企业最难的是生成令人信服的数据以建立合格的能够满足生产研究需要的单克隆细胞。这种担忧特别适用于老化的细胞库，其单克隆概率可能很低。但是，存在处理此类问题的策略和方法。一种选择是重新建立单克隆细胞库，这是一项耗时且成本高昂的工作。其他方法还包括使用下一代测序(NGS)技术，以评估单克隆性并验证令人信服的生产稳定性和重现性。我们发现大型生物制药企业在让他们的细胞库满足安全规范方面没有什么困难，特别是当RCB已经被很好地表征，而且可以委托CDMO准备GMP细胞库。基因检测往往很简单，生物制药公司花费大量时间和金钱来改进其细胞系的遗传特征和表达机制。但是细胞库测试会产生大量费用，完整的安全和特性测试成本可能接近百万元。生物制药公司对这些成本问题的反应各不相同。一些客户询问从最有可能失败的检测开始是否合适，他们认为一旦清除了这个障碍，他们就可以通过剩余的测试——并且可能节省一些钱。我们的回答是：当然可以尝试这种策略，但是表征他们的细胞需要更长的时间。来自大学、研究机构和其他非GMP来源的RCB是否可以开发MCB？许多RCB来源于此类机构。如果这些RCB的材料和过程被正确记录，包括有关质粒和宿主细胞系的来源、储存、处理和测试的信息，则此类细胞是可以制备MCB的。MCB是在GMP条件下生产的，合同实验室和制造组织往往精确地记录原材料和建立过程。因此，当这些公司从头到尾参与细胞库建立过程时，几乎不会出现问题。但监管机构经常要求生物制药企业从RCB的创建中查找文件或者记录，以考虑所有外来因子污染的机会。该要求可能会给无法控制用于生成RCB的材料的生物制药企业带来问题。学术和研究机构通常不会根据GMP建立他们的细胞库，这可能会影响RCB原材料的可追溯性。我们经常遇到可追溯性问题。我们注意到一家公司在年使用了胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶或其他一些动物源性原材料，这种情况就需要询问该公司是否可以提供这些材料的分析证书(CoA)。有时，公司会使用现在无法追踪的材料生产的RCB。类似的文件问题出现在遵循学术指导并寻找可以通过临床试验采用其候选药物，或者更大合作伙伴的生物技术初创公司。当客户问我他们如何简化细胞库表征时，我建议他们记录所有培养基成分，尤其是动物源性原材料，就好像他们的RCB是在GMP内生产的一样，以提高今后溯源的可能性。所以问题归结为文件和记录。如果可以为特定材料生成CoA，则审核员可以评估该材料的病*和微生物风险。例如，CoA可以确定用于储存细胞的大量FBS是经过伽马射线照射的，因此对病*造成的风险最小。同样，适用性证书或原产地证书可用于评估传染性海绵状脑病(TSE)的风险。但是，如果无法找出任何文件，那么评估细胞库的风险就变成了猜测——而生物制药企业是不希望处于这种情况的，也最好不要出现这种情况。公司是否在培养基优化中，使细胞库适应化学成分确定的培养基方面取得研究数据？如果必须这样做，这对质保文件有什么影响？各个公司正在朝着这个目标努力，他们正试图尽早使细胞适应不含动物源成分的培养基。例如，可以与一家开发RCB的公司合作。研究人员已将其应用于无血清培养基，这对今后的药物研究很有帮助。不过，我们注意到，马血清在适应期间使用，在此之前，细胞系已经在FBS中生长，所以我们仍然需要询问所有相关的CoA。拥有这些信息是很有帮助的。在MCB阶段，原材料文件有助于确定细胞库需要进行哪些病*和微生物测试才能满足规范。如果您的原材料是可追溯的，在于不了解您的细胞系历史的情况下，那么您更有可能获得监管机构的认可。存储和处理需要对细胞库进行哪些稳定性测试？在建立了第一轮的WCB之后，企业通常会将其主细胞库搁置几年，然后再重新启用它们以用于生产或测试目的。许多公司的稳定性质控文件规定每五年对MCB进行一次评估，以确保这些细胞是活的，并且可以为早期上游处理生产必要的材料。通常，该测试很简单，包括在摇瓶中扩增，然后监测几个相关的培养步骤。如果WCB每年解冻或每年多次使用于生产原料药（药物原液），则不需要进行额外评估。一个成功的生产过程，需要完成必要的测试，建立支持它的WCB的稳定性数据。与储存、处理和转移相关的哪些因素会影响细胞库的质量，如何预防此类问题？必须使用专用实验室和设备来准备和建立细胞库。在具有并行项目的区域执行此类活动可能会使细胞库的纯度/无菌性处于危险之中。微生物细胞库必须在低于-70℃的温度下储存，但建议将它们储存在低于-℃的液氮冰箱中，低温储存是保存哺乳动物细胞库的要求。运输通常使用干冰或液氮容器进行。不正确的储存和运输温度会影响细胞活力和可恢复性。因此，生物制药企业需要确保正常和维护冷链。这包括识别保持温度，并保持主要细胞库存储容器完整性的运输容器。温度监测设备有助于跟踪温度的偏移。我们必须记住，细胞库代表着大量的时间和金钱。您最不想做的事情是运送细胞库并发生温度问题或温度偏移。公司必须降低运输风险。通常，涉及在运往不同地点的两次货物之间拆分细胞库。大公司通常将细胞库存储在两个地点；小公司经常在几个存储库之间分配他们的材料。老化的细胞库会引起什么问题，如何处理这些问题？与新建立的细胞库相比，传统细胞库可用的数量可能更少。此外，旧细胞库的不当储存会降低细胞活力和可恢复性。更换老化的细胞库需要创建一个新的细胞库，然后进行与相应细胞库相同类型的测试，包括评估细胞库的同质性、生长、生产力和病*/微生物安全性。然后，新细胞库必须进行可比性研究，以确认其产品属性与其前身相匹配。可追溯性是另一个挑战。细胞库越老，重建它就越困难。科学家们转向不同的组织；文件被塞进柜子里深藏。很难按照监管机构的要求报告MCB的历史。监管机构可能与无法完全重建其细胞库历史的公司合作。最近与一位生物药企业合作，该企业无法解释其细胞系进化过程中使用的所有动物来源成分。除了通常要求的MCB病*测试外，FDA还允许该公司进行下一代测序（NGS）。该机构的理由是，NGS方法的广泛可检测性可以减轻由细胞系进化历史中的差距带来的风险。尽管监管机构可能会提供这样一条补救的道路，但生物制品公司不应假设广泛的可追溯性差距总是可以通过这种方式解决。最好的方法是记录整个细胞系开发过程中采取的步骤。选择合适的CDMO关于与合同合作伙伴合作进行细胞库制备和表征，您对生物制药企业有什么建议？CDMO几乎总是需要进行细胞库的评估，因为它们可以处理阳性对照是生物制药公司能不能引入其生产设施的病*和微生物检测。通常，开发人员会为CDMO提供一些RCB小样、生长说明和专用培养基（如果适用）。然后，CDMO科学家扩展这些细胞，为选定的一组表征测试生成足够的材料。合同实验室知道他们在做什么，拥有“现成的”必要测试方法，并在适当的质量体系下运行以进行GMP细胞库表征。很少有生物制药企业具备在内部进行MCB测试所需的一系列分析能力。尽管成本高昂，但外包细胞库活动是一种关键的风险缓解策略。公司必须在MCB阶段识别质量和污染风险。您也不想在开始生产药品时，才发现您的细胞系有问题。MCB将陪伴您数十年，因此您必须对其进行彻底评估。生物制药开发人员会发现，CDMO在对问题的响应能力、对特殊测试需求的灵活性以及报告结果的时间方面有所不同。但许多CDMO完全有能力生成和表征细胞库，这些细胞库将可以通过监管机构的审查。细胞库的准备和测试是合同实验室的直接活动。他们使用平台流程进行细胞准备，实施和验证了的广泛化验，并且在MCB和WCB的准备和测试方面拥有丰富的经验。首次选择合同合作伙伴时，生物制药企业应考虑实验室的经验和声誉。谨慎地向两三个组织征求建议，然后比较细胞库生成、测试、存储和运输的成本和时间表。生物制药开发人员还应该询问细胞库的大小，以尽量减少频繁建库的需要。例如，申办者可能要求一个MCB超过个样品，每个WCB要求超过个样品。
参考：
1ICHQ5A(R1)
ualityofBiotechnologicalProducts—ViralSafetyEvaluationofBiotechnologyProductsDerivedfromCellLinesofHumanorAnimalOrigin.EuropeanMedicinesAgency:Amsterdam,TheNetherlands,;
