彭洋现在哪里就诊 http://baijiahao.baidu.com/s?id=1706328117978671209&wfr=spider&for=pc近期，Cell刊登了清华大学施一公课题组大作：Structuralbasisofγ-secretaseinhibitionandmodulationbysmallmoleculedrugs，该文阐述了γ-分泌酶结合三种小分子抑制剂(GSI)和一种调节剂(GSM)的冷冻电镜结构，并首次展现了γ-分泌酶结合底物与药物的过程。提到大名鼎鼎的γ-分泌酶，肯定有小伙伴抢答“它是淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的切割酶，与阿尔茨海默症有关”，但是今天，我们要说的是γ-分泌酶的另一重身份——Notch通路激活的重要切割酶。Notch信号通路是一条在进化中高度保守的，决定细胞命运的重要信号通路之一。
别具一格的Notch
大多经典的信号通路(如RTK信号通路)遵循“信号-受体-信号转导(产生二次信使)-细胞核-转录”的信号级联放大模式，而Notch通路则不按照这个套路出牌：Notch受体与邻近细胞的配体相互作用介导短时通讯，从细胞表面到细胞核基因组的信号是直接的，线性的，没有信号级联放大的过程。
图1.Notch信号通路[1]
经典信号通路中，细胞膜上的受体就像信号接收器，接受外源信号，继而发生下游级联放大反应，其配体可源于细胞外基质。而Notch信号通路的激活至少需要两个细胞，发生细胞之间的直接“对接”，细胞A提供配体，细胞B提供受体，是一种独特的依赖蛋白酶切的信号传导模式。
Notch通路的著名“三剪”
Notch通路由四部分组成：Notch受体(Notch1/2/3/4)，Notch配体(Delta-likeligands,DLL1/3/4；Jaggedligands,JAG1/2)，CSL-DNA结合蛋白，下游靶基因(Hes家族，MYC等)。以上4个因素，任何一个因素改变都会对Notch信号传递产生影响。Notch的受体和配体都是膜蛋白，Notch受体与配体结合后，经过酶切，把有转录调节活性的Notch蛋白片段(NICD或ICN)释放出来，再与转录因子CSL结合，调节下游基因表达。
图2.Notch信号通路激活示意图[2][3]
行走江湖，Notch有著名“三剪”。一剪Notch现形：Notch以无活性的单肽前体形式在内质网中合成，此时的未成熟蛋白包括Notch膜外受体部分，跨膜区域以及胞内结构域NICD三个部分。Notch初始蛋白被合成之后，转运至细胞高尔基体内，被高尔基体网络中的Furin转化酶蛋白水解切割，经过第一次酶切(S1cleavage)后形成异二聚体形式的成熟Notch受体并转运至细胞表面。二剪内外殊途：细胞膜上成熟Notch异二聚体的胞外结构域与其他细胞的配体结合，受体配体结合后发生构象变化，在ADAM金属蛋白酶(ADAM10或ADAM17/TACE)切割的作用下发生第二次酶切(S2cleavage)，此刻受体膜外部分完全被切掉。三剪“成就”Notch：第二次酶切后剩余的其他部分，被γ-分泌酶进行关键性的最后一切(S3cleavage)，形成可溶性NICD入核。NICD进入细胞核后，与CSL等转录蛋白结合，将原本“协同抑制复合物”转换为“协同活化复合物”，进而与DNA形成多蛋白-DNA复合体，激活下游相关基因的表达。Notch信号通路机制就是这么简单，那么在实验中是怎样研究Notch通路的呢？
Notch通路的基础研究“小套路”
不像其他通路(如RTK、MAPK等)，Notch通路没有磷酸化之类的指标可以检测。在文献里面最直观的实验手段就是使用siRNA、shRNA特异性沉默Notch蛋白，或者使用小分子抑制剂，如γ-分泌酶抑制剂(GSI)。以LiYi等人的Notch相关研究文献(PMID
为例，作者团队通过不同实验方法验证了神经胶质瘤起始细胞(GICs)中完整的Notch1-CXCR4-PI3K信号通路，证明了Notch1通过调节趋化因子系统CXCL12/CXCR4，促进胶质瘤起始细胞的侵袭、自我更新和生长。
图3.LiYi等人验证Notch与CXCR4相关通路的实验思路图
■RNA沉默(siRNA与shRNA)该团队首先通过磁珠分选(MACS)的方法，富集U87和U胶质瘤细胞的CD+(肿瘤起始细胞标记物)细胞。CD+胶质瘤细胞球中表现出高的Notch1活性(图4a，橘红色荧光)。同时，免疫荧光结果显示，与CD+胶质瘤细胞球中，Notch1阳性胶质瘤细胞占很大比例，CXCR4阳性胶质瘤细胞仅占CD+胶质瘤细胞球团的一小部分。但是，这些CXCR4与Notch1荧光染色共定位于球体的周围(图4b*色荧光共定位)。
图4.a.CD和Nestin的免疫荧光染色确定GICs表型；b.GICs肿瘤球中Notch1和CXCR4的共定位免疫荧光染色确定蛋白互作关系[4]
为进一步研究Notch1在GICs中发挥的作用，作者团队建立了稳定的Notch1敲降神经胶质瘤起始细胞系(U87-GIC/U-GICshNotch1)。如图5a所示，shNotch1细胞系中Notch1信号通路蛋白(Notch1,Hes1)低表达，CXCR4表达显著下调。并且shNotch1组中Notch1的下调可以显着抑制GICs的自我更新、侵袭和迁移，如图5b-d。
图5.a.建立稳定的shNotch1细胞系；b.肿瘤球形成实验；c-d.肿瘤细胞侵袭和迁移实验[4]
■使用小分子抑制剂γ-分泌酶抑制剂是最早发现和最大的一类Notch通路靶向药物，能阻止Notch受体的第3次酶切，从而阻止NICD的释放。前面提到，Notch1影响GICs的自我更新和生长，为进一步证明这一机制，作者团队使用了γ-分泌酶抑制剂MK来抑制Notch1途径。MK剂量依赖性降低了活化的Notch1(NICD)的蛋白表达。同时在U87/UGICs中，Notch1通路被shRNA或MK下调，CXCR4的表达以及AKT和mTOR的磷酸化水平也被显着抑制。
图6.在U87GICs和UGICs中验证Notch1-CXCR4-AKT/mTOR通路[4]
此外，NorihikoSaito等人证明了GICs对γ-分泌酶抑制剂敏感程度并不相同(PMID。根据GICs对γ-分泌酶抑制剂给药的反应分为Responder和Non-Responder组。Responder组中，Notch1、Notch1NICD和Notch1下游相关蛋白(包括Hes1、Hes3和Hes5)均高表达，在Non-Responder组中则不然。γ-分泌酶抑制剂DAPT以剂量依赖性方式抑制NICD、Hes1、Hes3和Hes5的表达，而Notch1的表达没有改变。同样都是神经胶质瘤起源细胞，但这两组细胞对DAPT的响应并不相同。
图7.DAPT对不同细胞系的Notch1相关蛋白的影响[5]
总结：1、Notch信号通路是线性的信号通路。2、Notch信号通路激活后的检测，通常是检测通路被激活后的NICD或者下游一些靶基因。3、针对Notch信号通路的抑制剂，最主要的一大类是γ-分泌酶抑制剂，但是并不是所有的细胞系都对抑制剂高度敏感，要结合文献选择抑制剂。
γ-分泌酶(γ-secretase)抑制剂(GSI)
DAPT具有口服活性的γ-secretase抑制剂，具有神经保护活性，并可用于自身免疫性和淋巴增生性疾病，退化性疾病和癌症的研究。
YO-二肽类γ-secretase抑制剂，裂解Notch和APPL的IC50分别为2.92nM和2.64nM。
BMS有效的γ-分泌酶抑制剂，抑制β-淀粉样前体蛋白裂解的选择性比Notch裂解更高。
LY-γ-分泌酶抑制剂，能够抑制Aβ40蛋白的产生，同时抑制Notch分裂。
靶向Notch转录复合体的抑制剂
IMR-1Notch抑制剂，阻止Maml1募集到染色质上的Notch三元复合体(NTC)，抑制Notch靶基因转录。
IMR-1ANotch抑制剂，IMR-1的酸代谢物，相对于IMR-1的效力增加。
CB-靶向NOTCH转录复合体，具有抗肿瘤活性。
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缩写：ADAM
isintegrinandmetalloproteinasedomain-containingproteinTACE
NF-convertingenzymeNICD:NotchintracellulardomainCSL:CBF1/Suppressorofhairless/Longevity-assurancegene-1MAML:Mastermind-likeproteinSKIP:Ski-interactingproteinGICs:Gliomainitiatingcells
参考文献1.DomingosHenrique,etal.MechanismsofNotchsignaling:asimplelogicdeployedintimeandspace.Development.Feb1;(3)
ev.2.JosephAClara,etal.Targetingsignallingpathwaysandtheimmunemicroenvironmentofcancerstemcells-aclinicalupdate.NatRevClinOncol.Apr;17(4):-.3.JoseManuelPerezGarcia,etal.First-in-humanphase1-2AstudyofCB-,anoralProtein-ProteinInteractionInhibitortargetingpan-NOTCHsignallinginadvancedsolidtumorsandbloodmalignancies.JournalofClinicalOncology36,no15_suppl.3.NaokoTakebe,etal.Targetingnotchsignalingpathwayincancer:clinicaldevelopmentadvancesandchallenges.PharmacolTher.Feb;(2):-9.4.LiYi,etal.Notch1signalingpathwaypromotesinvasion,self-renewalandgrowthofgliomainitiatingcellsviamodulatingchemokinesystemCXCL12/CXCR4.JExpClinCancerRes.Aug5;38(1):.5.NorihikoSaito,etal.AhighNotchpathwayactivationpredictsresponsetoγsecretaseinhibitorsinproneuralsubtypeofgliomatumor-initiatingcells.StemCells.Jan;32(1):-12
