成都治白癜风最好的医院 http://m.39.net/baidianfeng/a_4594528.html简介
从活性和凋亡等多个表征评估细胞健康状态能协助我们深入了解多种情况下，包括候选药物，特定通路的激活、抑制剂处理以及报告基因的表达所带来的影响。目前有多种方法可用于测定细胞健康状态，其中比较常见的是通过微孔板读板机结合荧光检测法。该应用指南展现了在SpectraMaxiD3多功能微酶标仪上应用EarlyToxTM系列细胞活性检测试剂盒进行细胞健康评估。
优势
针对SpectraMaxiD3酶标仪全面优化的检测方法，节约实验开发所需的时间
简单，均一的实验流程更大程度减少细胞处理的步骤
高分辨率触摸屏方便进行快速方法学的设定
SoftMaxPro软件预设的模板加速数据的分析
EarlyToxTM细胞死活检测试剂盒
该试剂盒包含两个适用于标记哺乳动物细胞死活的标记物。其中，CalceinAM广泛用于标记活细胞。非荧光的CalceinAM可穿透完整的细胞膜，进入胞浆后在细胞内脂酶的作用下转换成具有荧光的Calcein。因此，在CalceinAM标记下活细胞胞浆会发出强烈的绿色荧光。有些实验中只涉及到活细胞的标记，如细胞增殖实验等，仅需要EarlyToxTMLiveCell检测试剂盒提供的CalceinAM（货号R小包装，货号R大包装）。
Ethidiumhomodimer-III（EthD-III）是几乎无荧光的标记物，其不具有穿透完整细胞膜的能力。在细胞死亡过程中，往往会出现细胞膜完整性的受损。此时EthD-III可进入细胞并结合核酸，在死细胞中产生强烈的红色荧光。EthD-III染色可用于准确评估细胞*性事件对膜完整性的影响。
Calcein和EthDIII的荧光信号均可用SpectraMaxiD3微孔板读板机进行检测，并能在SoftMaxPro软件中结合预设的EarlyToxLive/Dead模板迅速完成分析。
EarlyToxGlutathione检测试剂盒
该试剂盒利用对GSH具有高亲和力的细胞膜可渗透染料monochlorobimane（MCB）进行细胞内GSH水平的检测。在内源GlutathioneS-transferase（GST）酶处理下，MCB与GSH进行反应并产生nm激发，nm发射的蓝色荧光，强度与细胞内GSH的水平对应，并随着凋亡的发生下降。与主流的检测方法不同，EarlyToxGlutathione检测法可直接在微孔板中分析完整的活细胞，无需进行细胞收集，离心等耗时且易引入误差的操作。同时，预设的EarlyToxGlutathione模板简化了仪器的设置和软件分析过程。
EarlyToxCaspase-3/7R检测试剂盒
EarlyToxCaspase-3/7R检测试剂盒专门为微孔板读板机提供了一步式均相检测方法。荧光底物（Ac-DEVD）2-R含有2个DEVD共识目标序列，并在细胞裂解产物中相关酶的作用下逐步完全水解，释放绿色荧光染料rhodamine（R）并伴随显著的荧光信号（nm激发，nm发射）增加。简化的操作流程降低了对细胞数量的需求，同时避免多步操作所带来的误差。相应的SoftMaxPro模板库中提供预设模板用于EarlyToxR采集和分析。
材料
EarlyTox细胞死活检测试剂盒：小包装（两块微孔板通量，MolecularDevices货号R）；大包装（十块微孔板通量，MolecularDevices货号R）
EarlyToxGlutathione检测试剂盒：小包装（两块微孔板通量，MolecularDevices货号R）；大包装（十块微孔板通量，MolecularDevices货号R）
EarlyToxTMCaspase-3/7RAssayKit：小包装（两块微孔板通量，MolecularDevices货号R）；大包装（十块微孔板通量，MolecularDevices货号R）
HeLa细胞（ATCC货号CCL-2）
Staurosporine（Sigma货号S）
96孔黑色底部透明微孔板（Corning货号）
SpectraMaxiD3多功能微孔板读板机
方法
细胞处理
Hela细胞以L体系，20,个每孔的密度铺于黑色底部透明板中。在37°C、5%CO2培养箱培养过夜，细胞贴壁后，用不同的方法诱导凋亡。对于细胞死活检测，用2倍梯度稀释浓度范围为10M到40nM的taurosporine处理细胞24小时。对于Glutathione和Caspase-3/7R检测，则用2倍梯度稀释浓度范围为5M到5nM的Staurosporine处理细胞4小时。每个药物浓度设置4重复。
EarlyTox细胞死活检测试剂盒
配置2倍工作处理液：在PBS缓冲液中加入CalceinAM和EthD-III储液至染料终浓度均为6M。每实验孔中加入L2倍工作处理液使最终反应体系为L，染料终浓度均为3M。室温孵育1小时后用SpectraMaxiD3微孔板读板机进行顶部或底部读取。参数设置依照表1所示使用SoftMaxPro完成。注意，必要时也可以先移除培养液后加入1倍工作处理液进行染色，有利于降低背景荧光信号。SoftMaxPro软件预设的EarlyToxLiveDeadassay模板会自动计算绿色荧光/红色荧光比例，并根据药物浓度进行作图。如有需求，模板也可以计算死活细胞的比例，不过必须在实验板中设置额外的对照。
EarlyToxGlutathione检测试剂盒
配置20MMCB工作处理液：稀释20L10mMMCB储液于10mLPBS中。移除实验板的培养基后每孔细胞加入LMCB工作处理液，37°C进行孵育。孵育1小时和2小时后用SpectraMaxiD3微孔板读板机按照表1的参数进行荧光检测。
EarlyToxCaspase-3/7R检测试剂盒
配置荧光底物工作液:按照50L每1mL的比例加入酶底物（AC-DEVD）2-R（2mM）至细胞裂解或检测缓冲液中。每孔细胞中加入L荧光底物工作液，使终体系为L每孔，底物终浓度为50M。室温孵育1小时和2小时后用SpectraMaxiD3微孔板读板机按照表1的参数进行荧光检测。
结果
EarlyTox细胞死活检测试剂盒
Staurosporine处理在Hela细胞上引起明显的浓度反应关系，可以通过计算活细胞（绿色荧光）和死细胞（红色荧光）的比例轻易进行量化（图2）。一般来说，孵育2小时的细胞样本的RFU高于孵育1小时（结果未显示）。此次检测中使用4参数曲线拟合出EC50值为nM。
图2：EarlyTox细胞死活检测:Staurosporine处理Hela细胞24小时的浓度反应曲线。CalceinAM和EthD-III孵育细胞一小时后进行检测。依据绿（nm发射波长）/红（nm发射波长）RFU值的比值绘制浓度曲线。数据使用4参数曲线拟合。EC50值为nM。
EarlyToxGlutathione检测试剂盒
Staurosporine处理4小时后HeLa细胞出现凋亡，并伴随细胞内Glutathione水平的下降，其可用EarlyToxGlutathione检测法进行分析。随着Staurosporine浓度的提升，荧光信号逐渐下降并可用SpectraMaxiD3微孔板读板机检测。结果在SoftMaxPro软件中使用4参数曲线拟合。虽然荧光信号值随着时间的推移而增加，孵育1小时和孵育2小时所得的EC50值是相近的nM和nM（图3）。
图3：EarlyToxGlutathione检测:Staurosporine处理Hela细胞4小时的浓度反应曲线。细胞分别和染料孵育1小时（绿线）和2小时（蓝线）。在SoftMaxPro软件中使用4参数曲线拟合。EC50值分别为nM和nM。
EarlyToxCaspase-3/7R检测试剂盒
Staurosporine处理4小时后HeLa细胞出现凋亡并用EarlyToxCaspase-3/7R检测法进行分析。凋亡细胞对应的荧光信号可用SpectraMaxiD3微孔板读板机进行检测。结果在SoftMaxPro软件中使用4参数曲线拟合。底物孵育1小时和2小时所得的EC50值是相近的nM和nM(图4)。
图4.EarlyToxCaspase-3/7R检测:Staurosporine处理Hela细胞4小时的浓度反应曲线。细胞分别和染料孵育1小时（红线）和2小时（蓝线）。在SoftMaxPro软件中使用4参数曲线拟合。EC50值分别为nM和nM。
总结
结合SpectraMaxiD3微孔板读板机，EarlyTox细胞活性系列试剂盒提供了直接、方便的细胞死活或凋亡的检测方法，并且使用微孔板进一步提升通量。不同孵育时间的结果一致性增加了实验流程的灵活性。SoftMaxPro软件中预设的模板提供了优化的检测参数设定并通过自动数据分析减少获得数据所需的时间。
SpectraMaxiD3多功能微孔板读板机
SpectraMaxiD3微孔板读板机设计上引入了大尺寸，高分辨率触摸屏并内嵌软件包便于用户自定义模板，使用预设模板和在无需专用电脑工作站的前提下进行实验。仅需轻轻一点，内置的近场通讯（NFC）功能就能提供自定义模板和数据，节约您的宝贵时间。
