培养细胞的形态观察和计数 [复制链接]

了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法。

一、材料和标本培养中的HeLa细胞(人子宫颈癌上皮细胞)、NIH3T3(小鼠成纤维细胞)、HL60细胞(人白血病细胞)

二、器材和仪器倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管

三、试剂0.3％台盼兰染液、0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液

一、培养细胞的形态观察

(一)原理

体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞，如HeLa细胞、NH3T3等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如HL—60，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。

(二)操作

l．将细胞培养瓶从37℃二氧化碳培养箱(或温箱)中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。

2．打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。

3．调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是10X物镜。

(三)结果

贴壁细胞一般有两种形状，即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片，如HeLa细胞。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起，细胞群常借原生质突连接成网，如NIH3T3(参照照片)。

贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。悬浮细胞当边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之，则较差或已死亡。由于培养基内有pH指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙*色时，细胞一般生长状态较好；呈淡*色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。

二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定

(一)在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是进行实验必不可少的一种基本技能。

(二)操作

1．将培养瓶中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液lml,静置3～5分钟，待见到细胞变圆，彼此不连接为止。

2．将试管中的培养液倒回培养瓶中，并轻轻进行吹打，制成细胞悬液。

3．取细胞悬液0.5ml，加入0.3％台盼兰染液0.5ml，混合后染色3～5分钟。

4．滴加少许已染色的细胞悬液于放有盖片的细胞计数板的斜面上，使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。

5．在普通光镜10X物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不效右。

(三)结果

按下式进行细胞浓度的计数：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×

注：4大格中的每一大格体积为0.1mm3。1ml=l，大格，因此，1大格细胞数×=细胞数／ml。

进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液，并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平均值。

1、在观察时应将显微镜的光调弱，这样有利于更加清晰的观察到计数板横竖格线。在镜下可见细胞分散在各处，健康的细胞体完整，透明不着色；凡是着色的细胞均可视为不健康细胞或死细胞。可用此方法来分辨和判别死细胞和活细胞。

2、染色标本在计数细胞时必须在15分钟内检查计数完毕。因为台盼蓝染液可以将死细胞迅速地染上蓝色，再延长时间则活细胞也将逐渐着色。

3、应将消化的细胞充分吹打成单个细胞，否则会影响计数结果。