细胞的冻存
检查细胞
为了避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变，以及避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳动物细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。冻存细胞应做好标记和归档，以便后续使用。
悬浮细胞
①计数将要冻存的活细胞。细胞应处于对数生长期。
②rpm，离心5min沉淀细胞，使用移液管去除上清。
③以5×~1×cell/mL密度，在冻存液中再次重悬细胞。
④分装进冻存管，将冻存管置于4℃冰箱中15~30分钟。
⑤将冻存管放入程序冻存盒中，-80℃冰箱过夜后，转移到液氮中贮存
贴壁细胞
①按照传代操作消化细胞，获得细胞悬液并计数。
②~rpm，离心5min沉淀细胞，使用移液管去除上清。
③以1×~5×cell/mL的密度，在冻存液中重悬细胞。
④将细胞分装进冻存管，将冻存管置于4℃冰箱中15~30分钟。
⑤将冻存管放入程序冻存盒中，-80℃冰箱过夜后，转移到液氮中贮存。
#注意01
按照ATCC提供的细胞冻存液配方，在冻存前配制即可。
02
冻存的细胞应做好标记，并记录贮存位置，方便后续查找并使用
细胞的复苏
冻存细胞比较脆弱，需要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并且直接添加到完全培养基中，离心后去除冻存液培养，避免DMSO或其他成分对细胞生长造成影响。
直接铺板方法
①取出贮存的细胞，37℃水浴锅中快速融化。
②直接用完全培养基铺板细胞。细胞培养至12~24小时，更换新鲜的完全培养基，去除冻存剂。（某些细胞，如间充质干细胞，复苏后为避免细胞损伤不能离心，采取直接铺板法。）
离心法
①取出贮存的细胞，37℃水浴锅中快速融化。
②把1mL冻存细胞转移至9mL完全培养基中，rpm，离心5min收集细胞。
③去除含有冻存液的上清
④用完全培养基重悬细胞，接种到培养皿中。
#注意01
冻存及复苏流程应按照“慢冻速融”原则。
02
操作过程严格保证无菌：融化细胞时水面不能没过管口；将细胞拿进超净工作台时，用酒精喷雾或酒精棉消毒冻存管表面。
03
完全培养基应提前恢复至室温，并分装备用。
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24h后：对于贴壁细胞，确定是否贴壁，并估算存活率；对于悬浮细胞，检查外形（胞质透明度，颗粒度）。
冻存液
即用型细胞冻存液01
冻存液的特性：常用的冻存液是DMSO（二甲基亚砜）。可防止在低温（零度以下至-℃）保存细胞时细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。但是DMSO对细胞有毒性，细胞复苏后要快速去除。
细胞株对应的最适冻存配方需参考说明书、ATCC或文献。
部分无血清培养的细胞，冻存液也要用无血清的，例如BEAS-2B。
部分细胞使用商品化的无血清冻存液后，复苏存活率较低，推荐测试后再使用。
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