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细胞经常暴露在如氧化应激、温度变化、病*感染等压力条件下，为了抵御这些不利条件并将应激期间的损伤降至最低，细胞激活一种进化上保守的途径，称为整合应激反应（integratedstressresponse）。这一途径会触发翻译起始因子eIF2α的磷酸化，导致大多数mRNAs的翻译受到抑制。这种翻译重编程允许细胞保存能量并将其资源转移至细胞内稳态恢复。在此期间，整合应激反应也导致应激颗粒（stressgranules,SGs）的产生，即由mRNA和RNA结合蛋白组成的无膜细胞器。截至目前，虽已有许多研究报道SGs的成分，特性及其在疾病中的角色，然而人们对其生物学功能在很大程度上仍是未知的。
近年来，在活细胞中使用单分子成像技术的研究已逐步揭示SGs的mRNA募集动力学，但是仍不清楚将mRNA隔离到SGs是否对基因表达有任何影响。由于SGs的形成往往与翻译沉默相吻合，人们推测SGs直接导致应激下的翻译抑制，且普遍认为SGs中只包含非翻译mRNA。然而，却很少有直接证据支持这一猜想。
近日，来自瑞士弗里德里希·米歇尔生物医学研究所的JeffreyA.Chao课题组在Cell杂志上发表了一篇题为Single-MoleculeImagingRevealsTranslationofmRNAsLocalizedtoStressGranules的文章，在这项研究中，作者利用活细胞中mRNA翻译的单分子成像来重新验证上述假设，以明确的证据表明定位于SGs的mRNA可以完成翻译，且整个翻译周期能完整运行，同时可以观察到mRNA在胞浆和SGs之间的动态转换。总体而言，作者提出SGs的mRNA定位与翻译是相容的，并反对SGs在应激条件下抑制蛋白质合成的直接作用。
尽管大多数转录本在应激过程中受到抑制，但也有一些转录物，如ATF4是启动应激反应所必需的，并且在eIF2α磷酸化时优先翻译。为了描述翻译状态与应激时SGs对mRNA募集之间的关系，作者首先构建了ATF4-SunTag报告转录本，用于活体细胞翻译的单分子成像（见图1）。此外，为标记活细胞中的SGs，作者将SNAP-tag标记的G3BP1引入细胞系。通过给予细胞应激条件，翻译和非翻译mRNA可以通过SunTag信号的存在与否来区分，如前所述，SGs中存在大量非翻译mRNA，而令人惊讶的是，可以观察到翻译的ATF4-SunTagmRNA定位于SGs中，这表明SGs并不会抑制mRNA的翻译过程。
图1
图1.ATF4-SunTag报告基因mRNA的示意图以及用于单分子成像以揭示与SGs相关的mRNA翻译
考虑到在SGs和胞浆中均观察到非翻译和翻译的mRNAs，接下来，作者开始量化翻译状态与SGs定位之间是否存在任何相关性。通过图像分析系统，作者发现SGs中约有30%ATF4-SunTagmRNAs进行翻译，而胞浆中翻译mRNAs的比例稍高，约占mRNAs的44%。因此，相对而言，SGs中的mRNA翻译也并非罕见事件。重要的是，SGs定位的和胞浆定位的mRNAs在SunTag信号强度上没有显著差异，由于SunTag强度与核糖体数量相关，这表明核糖体在翻译mRNAs中的占有率在胞浆和SGs中是类似的。
一些研究支持SGs并非匀质的，包含稳定的核心和动态的外壳。那么mRNAs的翻译状态是否与其在SGs中的定位有关呢？为此，作者在固定细胞中进行3D斑点检测和SG分割实验，并测量从SGs中每个ATF4-SuntagmRNA到最近SGs边界的距离（边界无法精确定义）。分析表明，SGs中的大部分翻译（76%）和非翻译（65%）mRNA位于SGs边界的0.3μm范围内，然而，翻译的mRNA也可以在SGs内部更深层被检测到，并且更大的SGs中在距离边界1μm的地方也可以观察到。值得注意的是，与SGs边界的距离与翻译mRNA的SunTag强度无关。因此，这些数据结合先前研究共同表明，翻译状态与SGs内mRNAs的定位并无必然联系。
接下来，作者通过成像系统观察到SGs中的mRNAs可以正常经历“起始、延伸和终止”的完整翻译周期，与此同时，作者在一些影像中观察到少部分ATF4-SunTagmRNA在胞浆和SGs之间的动态转换，例如非翻译的mRNAs从胞浆到SGs或从SGs到胞浆的转移，但并没有改变其翻译状态。然而，通过分析发现与到达SGs的mRNA相比，离开SGs的mRNA更可能具有翻译活性，而非翻译的mRNA更倾向于定位到SGs，并且一小部分SGs的mRNA在离开SGs之前可以从非翻译状态切换到翻译状态。
上述观察表明与SGs相关的翻译对于ATF4-SunTagmRNA而言是相对常见的，这是由于其复杂的5’UTR和两个上游开放阅读框（upstreamopenreadingframes,uORFs）结构，使其在应激阶段翻译上调。那么，许多仅具有简单5’UTR结构的mRNA是否能在应激条件下完成翻译呢？
与上述ATF4-SunTagmRNA系统类似，作者在强力霉素诱导启动子下生成一个携带5’TOP-SunTag报告基因并稳定表达scFv-GFP、MCPHalo和G3BP1-SNAP的细胞系。利用单分子成像技术，作者检测到在正常条件下至少有76%的5’TOP-SunTagmRNA进行主动翻译，而在亚砷酸盐应激处理期间，翻译mRNA的比例显著降低到2%以下。有趣的是，应激条件下翻译分析显示，仅存在6/个翻译的胞浆mRNA和2/个翻译的SGsmRNA。这些数据表明，5’TOPmRNA的SGs相关翻译是罕见的，但并不是由于SGs本身的定位所致。
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图2.5’TOP-SunTag报告基因mRNA示意图，用于应激条件下SGs中的单分子成像
总的来说，这项研究通过单分子成像技术打破先前普遍认为的“SGs只包含非翻译mRNA且直接导致应激条件下的翻译抑制”的观点，并提出对细胞器内外的生物过程进行定量检测，对于了解细胞器功能而言是十分必要的。
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