河北治疗白癜风医院 http://m.39.net/pf/a_4555381.html流程
1：抗体验证
2：蛋白+抗体+磁珠孵育
3：RNA纯化
4：QPCR检测/高通量测序
1.1细胞裂解液的获取
1、将细胞培养至状态良好，吸除培养基，加5mlPBS，左右晃动，清洗细胞一次
2、加入1ml胰酶消化，消化完全后，加2ml完全培养基终止消化。
3、rpm，离心1min，去上清。
4、每1x个细胞加入l的RIPA裂解液。
5、每mlRIPA裂解液加10l的PMSF以及磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，翻转裂解2h，0rpm离心15min，取上清，-20℃保存。
1.2Western检测目的蛋白
1、先配置10%的分离胶，加乙醇静置20min，待分离胶凝固，吸除乙醇，再用水冲洗残余的乙醇，吸水纸吸去残液。加入配置好的5%的浓缩胶，插入梳子，静置20min，待浓缩胶凝固后拔出梳子。
2、安装好电泳装置，上样，先70V,15min，后V，90min。
3、转膜，湿转V稳压转min。
4、封闭，将PVDF膜放入5%的脱脂牛奶中，封闭30min。
5、TBST洗膜3次，每次5min。
6、孵育一抗（TBST稀释），4℃孵育过夜。
7、TBST洗膜3次，每次10min。
8、孵育二抗（TBST稀释），室温孵育1h。
9、TBST洗膜3次，每次10min。
10、按1：1的比例加入试剂盒中的两种发光剂，孵育1min。
11、显影、定影，扫描结果。
1.3磁珠与抗体结合
1、标记实验所需的1.5mlEP管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照。
2、吸取50l重悬后的磁珠悬液于每个1.5mlEP。
3、每管加入lRIPWashBuffer，涡旋震荡。
4、将1.5mlEP管置于磁力架上，待溶液澄清去上清，重复一次。
5、用l的RIPWashbuffer重悬磁珠，加入5g相应抗体于每个样品中，4℃孵育4h。
6、将1.5mlEP管置于磁力架上，弃上清。
7、加入lRIPWashBuffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次。
8、加入RIPWashBuffer，涡旋震荡后置于冰上。
1.4磁珠抗体复合物与蛋白结合
1、将上一步的EP管放磁力架上，去上清，每管加入l的RIPImmunoprecipitationBuffer。
2、迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，0rpm，4℃离心10min。吸取l上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml。4℃孵育过夜。
3、孵育完后，短暂离心，将EP管放磁力架上，待溶液澄清去上清，加入lRIPWashBuffer，涡旋震荡后将EP管放磁力架上，去上清，重复5次，总共清洗6次。
1.5RNA洗脱
1、用l的ProteinaseKBuffer重悬上述磁珠-抗体复合物，55℃孵育30min。
2、孵育完后，将EP管放磁力架上，将上清吸入一新的1.5mlEP管中，于每管中加入lRIPWashBuffer。
3、再加入l苯酚：氯仿：异戊醇（：24：1）涡旋震荡15s，室温下0rpm离心10min。
4、小心吸取上层水相，吸入另一新的1.5mlEP管中，于每管中加入l氯仿，涡旋震荡15s，室温下0rpm离心10min。
5、小心吸取上层水相，吸入另一新的1.5mlEP管中，每管加入l无水乙醇（无RNase），混匀，-20℃沉淀过夜。
6、孵育完后，0rpm，4℃离心15min，小心去上清。
7、加入l80%的乙醇，0rpm，4℃离心15min，小心去上清，打开盖，静置3min，晾干。
8、加入10lDEPC水溶解，-80℃保存。
1.6将RNA反转录成cDNA
1、配制如下表所示的反应体系。
RNA变性反应体系
2、将上述体系混匀，短暂离心，25℃温育5min。42℃温育60min，70℃孵育5min，终止反应。
3、qPCR检测。
4、q-pcr数据处理
ΔCt[normalizedIP]=(Ct[IP]-(Ct[Input]-Log2(InputDilutionFactor)))
%Input=2^(-ΔCt[normalizedIP])*%
我们的input通常为总量的1/10，即稀释了10倍，Log2(InputDilutionFactor)≈3.3
计算示例：
ΔCt=17.55-（14.05-3.3）=6.8%input=2^（-6.8）*%=0.%
2实验结果示例
2.1Western检测结果
目的蛋白在目的细胞中有表达，条带大小正常，可用于后续实验。
2.2qPCR原始数据及数据处理
详见原始数据excel表：RIP-QPCR数据
2.3柱状图
阳性对照：
结果说明：阳性对照实验：U1C蛋白免疫共沉淀，qPCR检测RNAU1的量。阴性对照为IgG蛋白免疫共沉淀，qPCR检测RNAU1的量。
图片说明：在XXX细胞中，XXXX能特异性结合靶标RNA，而XXX没有特异性的富集。
