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背景[1-6]
Y感受态细胞是GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformationmarker为：trp1，leu2，cyh2；报告基因为：lacZ，HIS3，MEL1。Y-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：(pGB和pACT2)或（pGBKT7和pGADT7）。
质粒pGB由pGBKT7改造而来，筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒pACT2与pGADT7的结构和功能类似，筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4C端~位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。
GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端~位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsivegene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。
正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait–BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率cfu/μgDNA。
Y感受态细胞操作方法：
1.CarrierDNA在每次使用前要通过加热处理使其变性为单链状态，步骤如下：CarrierDNA放95℃水浴或金属浴3min，快速插入冰中，静置3min，再次放95℃水浴或金属浴3min，快速插入冰中，静置3min以上。
2.取μl冰上融化的Y感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒0.5-3μg，CarrierDNA10μl，PEG/LiAcμl并吸打几次混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)。
3.将管放42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。
4.0rpm离心40s弃上清，ddH2Oμl重悬，离心30s弃上清。
5.ddH2O50μl重悬，涂板，29℃培养48-96h。
应用[7][8]
Y感受态细胞可用于酵母Coronin蛋白与Septin家族成员相互作用研究：
细胞周期(cellcycle)是细胞生命活动的基本过程，其精准调控对生物的生存、繁殖、发育和遗传均具有极其重要的作用。Septin是一个从酵母到人都很保守的基因家族，酿酒酵母中Septin主要组成包括：Cdc3p、Cdc10p、Cdc11p、Cdc12p和Shs1p/Sep7p,Septin结构的变化与细胞周期密切相关。肌动蛋白骨架(actincytoskeleton)是存在于细胞中复杂的蛋白质纤维网状结构，参与细胞形状的维持、细胞周期、信号转导、增殖分化以及基因表达调控等几乎所有的细胞生理过程。Coronin蛋白(Crn1p)是一种存在于真核生物中的、高度保守的与肌动蛋白骨架调控相关的蛋白质，在肌动蛋白细胞骨架的聚合和解聚过程中都发挥了重要的作用。但目前关于肌动蛋白骨架如何参与细胞周期的调控研究甚少。
本研究以酿酒酵母为研究材料，对酿酒酵母中Coronin蛋白与Cdc3p、Cdc10p、Cdc11p、Cdc12p和Shs1p/Sep7p之间的相互作用进行了初步探讨，并对后续工作提出了设想。主要研究结果如下：
(1)通过酵母双杂交实验筛选出Cdc11p与Crn1p之间具有相互作用。以酿酒酵母Sc基因组DNA为模板，扩增出基因CDC10、CDC11和CDC12的全长序列，大小分别为bp,bp和bp,构建酵母双杂交重组质粒pGBKT7-CDC10、pGBKT7-CDC11和pGBKT7-CDC12。pGADT7-CRN1分别同以上三个重组质粒分步转化酵母菌株Y,并通过对β-半乳糖苷酶活性的检测筛选出Cdc11p与Crn1p具有相互作用。
(2)通过Pull-down实验证实Crn1p与Cdc11p具有相互作用。以pMD19-T-CDC11为模板，扩增出基因CDC11全长序列，构建原核表达重组质粒pET28a-CDC11。重组质粒pET28a-CDC11和pGEX-4T-3-CRN1分别转化E.coliBL21(DE3)进行异源表达，得到Cdc11蛋白和Crn1蛋白。最终通过Pull-down实验证实Crn1p与Cdc11p之间的相互作用。
(3)通过免疫共沉淀实验探索Crn1p与Cdc11p之间的相互作用。用限制性内切酶SacI和NotI酶切重组质粒pET28a-CDC11和质粒pYES3/CT,构建酿酒酵母表达重组质粒pYES3/CT-CDC11,并转化酿酒酵母菌株BJ。同时在CRN1基因的C端融合Myc标签，构建BJCRN1-Myc且含有pYES3/CT-CDC11的过表达载体的酵母菌株。
通过对其进行诱导前和诱导后形态观察，发现当过表达Cdc11蛋白时，细胞表型异常，细胞子芽延长，且大部分细胞死亡。Co-IP检测时未得到目的条带，且总蛋白条带也较少，猜测由于细胞表型异常导致。因此，本论文初步证实肌动蛋白骨架调控蛋白Coronin与细胞周期调控家族蛋白Septin家族成员Cdc11蛋白具有相互作用，结合前期研究结果：Asr1p蛋白与Coronin蛋白之间具有相互作用，且Asr1p影响细胞周期，我们初步得出一条完整的肌动蛋白骨架调控细胞周期的信号通路。
参考文献
[1]Septin4,theDrosophilaOrthologofHumanCDCrel-1,AccumulatesinparkinMutantBrainsandisFunctionallyRelatedtotheNedd4E3UbiquitinLigase[J].JournalofMolecularNeuroscience.(1)
[2]StructuralandbiochemicalpropertiesofSept7,auniqueseptinrequiredforfilamentformation[J].EldarZent,IngridVetter,AlfredWittinghofer.BiologicalChemistry.(8-9)
[3]Newinsightsintothephylogeneticdistributionandevolutionaryoriginsoftheseptins[J].RyuichiNishihama,MasayukiOnishi,JohnR.Pringle.BiologicalChemistry.(8-9)
[4]Septinstructureandfunctioninyeastandbeyond[J].YounghoonOh,ErfeiBi.TrendsinCellBiology.(3)
[5]CoroninSwitchesRolesinActinDisassemblyDependingontheNucleotideStateofActin[J].MeghalGandhi,VéraneAchard,LaurentBlanchoin,BruceL.Goode.MolecularCell.(3)
[6]Actinnucleationandelongationfactors:mechanismsandinterplay[J].MelissaAChesarone,BruceLGoode.CurrentOpinioninCellBiology.(1)
[7]Nuclearactindynamics–Fromformtofunction[J].MariaK.Vartiainen.FEBSLetters.(14)
[8]李国涛.酵母Coronin蛋白与Septin家族成员相互作用研究[D].云南师范大学，.
