对于CAR-T细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞，CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的，因此，CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项，监管部门建议应采用流式细胞法检测CAR转染阳性率。
目前有针对CAR不同结构区域的检测方法，包括针对CAR抗原结合位点的，比如CD19抗原和抗独特型抗体，或针对轻链或铰链区的抗Fab抗体或ProteinL蛋白（表1）。
其中，针对抗原结合部位的CAR阳性率检测方法因其具有更好专属性而被广泛使用。ACROBiosystems大团子整理了针对CAR抗原结合位点来检测CAR阳性表达率的相关案例，快来一起学习吧。
案例1：利用生物素标记BCMA蛋白检测anti-BCMACAR表达阳性率
检测方法：流式细胞术
检测仪器：BDFACSCalibur流式细胞分析仪
样本信息：转染Anti-BCMACAR的人原代T淋巴细胞
主要试剂：
生物素标记BCMA蛋白(BiotinylatedHumanBCMA/TNFRSF17Protein,Fc,AvitagDMFFiled,ACROBiosystems,Cat.No.BC7-H82F0)；PE标记的链霉亲和素(PEStreptavidin,Biolegend,Cat.No.)
简要流程：
1、将anti-BCMACAR基因通过慢病*质粒转染，整合到来自患者的自体T细胞基因中；
2、利用anti-BCMACAR特异性结合BCMA蛋白的特性，将生物素标记的BCMA蛋白（ACROBiosystems,Cat.No.BC7-H82F0）标记到Anti-BCMACAR-T细胞表面；、利用生物素特异性结合亲和素的特性，将PE标记的链霉亲和素（Biolegend,Cat.No.)作为荧光二抗，标记到Anti-BCMACAR-T细胞表面；
4、用BDFACSCalibur流式细胞分析仪进行检测分析。
检测结果：
结果显示1号患者Anti-BCMA-CART细胞阳性率在52.72%，2号患者Anti-BCMA-CART细胞阳性率在7.49%.
HumanTcellsweretransfectedwithanti-BCMACARandculturedfordays.Threedayspost-transfection,1e6cellswerefirstincubatedwith50ulbiotinylatedhumanBCMAprotein(Cat.No.BC7-H82F0,8ug/ml),washedandthenstainedwithPEStreptavidinandanalyzedbyflowcytometry.(DataarekindlyprovidedbyPREGENEBiopharma)
案例2：利用PE标记CD19蛋白检测anti-CD19CAR阳性表达率
检测方法：流式细胞术
检测仪器：BDFACSCelesta流式细胞分析仪(BDBiosciences)
样本信息：Anti-CD19CAR-29细胞
主要试剂：
PE标记的CD19蛋白（PE-LabeledHumanCD19(20-)Protein,HisTag(Site-specificconjugation)ACROBiosystems,Cat.No.CD9-HP2H）
简要流程：
1、用含10%FBS的DMEM培养基在7℃，5%CO2培养箱中培养Anti-CD19CAR-29细胞。
2、收集细胞，进行细胞计数及存活率测定，等分细胞悬液，每管2×10活细胞（Anti-CD19-CAR阳性表达率为98%，注意细胞存活率必须大于等于95%）。
、加入L稀释后的PE标记CD19蛋白（ACROBiosystems,Cat.No.CD9-HP2H）（1:50稀释），4℃避光孵育1小时。
4、用含2%BSA的PBS缓冲液洗涤细胞三次，并用L的PBS重悬细胞。
5、转移细胞至流式管进行流式细胞分析。
检测结果：
结果显示Anti-CD19CAR阳性表达率为%
1e6oftheanti-CD19CAR-29cellswerestainedwithμLof1:50dilution(2μLstocksolutioninμLFACSbuffer)ofPE-LabeledHumanCD19(20-),HisTag(Cat.No.CD9-HP2H).PEStreptavidinwasusedasnegativecontrol(QCtested).
案例：利用FITC标记anti-FMC6antibody检测anti-CD19(FMC6)CAR阳性表达率
检测方法：流式细胞术
检测仪器：BDFACSCelesta流式细胞分析仪(BDBiosciences)
样本信息：Anti-CD19CAR-29细胞
主要试剂：
FITC标记的抗FMC6抗体（FITC-LabeledMonoclonalAnti-FMC6scFvAntibody,MouseIgG1(Y45)ACROBiosystems,Cat.No.FM-FY45）
简要流程：
1、用含10%FBS的DMEM培养基在7℃，5%CO2培养箱中培养Anti-CD19CAR-29细胞。
2、收集细胞，进行细胞计数及存活率测定，等分细胞悬液，每管2×10活细胞（Anti-CD19-CAR阳性表达率为98%，注意细胞存活率必须大于等于95%）。
、加入L稀释后的FITC标记抗FMC6抗体（ACROBiosystems,Cat.No.FM-FY45）（1:50稀释），4℃避光孵育1小时。
4、用含2%BSA的PBS缓冲液洗涤细胞三次，并用L的PBS重悬细胞。
5、转移细胞至流式管进行流式细胞分析。
检测结果：
结果显示Anti-CD19CAR阳性表达率为%
2e5ofAnti-CD19CAR-29cellswerestainedwithμLof1:50dilution(2μLstocksolutioninμLFACSbuffer)FITC-LabeledMonoclonalAnti-FMC6scFvAntibody,MouseIgG1(Cat.No.FM-FY45)andisotypecontrolrespectively.FITCsignalwasusedtoevaluatethebindingactivity(QCtested).
案例4：利用CD19,Fctag蛋白检测anti-CD19CAR阳性表达率
检测方法：流式细胞术
检测仪器：NovoCyteFlowCytometer流式细胞分析仪
样本信息：Anti-CD19CAR-29细胞
主要试剂：
HumanCD19,Fctag蛋白（HumanCD19(20-)Protein,FcTag,lowendotoxin,Acrobiosystems,Cat.No.CD9-H）；FITCanti-humanIgGFcantibody(Biolegend,Cat.No.)
简要流程：
1、将anti-CD19(FMC6)scFvRFP基因通过质粒转染，整合到Expi29细胞基因中，命名为Anti-CD19CAR-29细胞；
2、利用anti-CD19(FMC6)scFv特异性结合CD19蛋白的特性，将CD19,Fctag蛋白（Acrobiosystems,Cat.No.CD9-H）标记到Anti-CD19CAR-29细胞表面；
、将荧光二抗FITCanti-humanIgGFcantibody(Biolegend,Cat.No.)标记到Anti-CD19CAR-29细胞表面；
4、用NovoCyteFlowCytometer流式细胞分析仪进行检测分析
检测结果：
结果显示CD19,Fctag蛋白能够与Anti-CD19CAR-29细胞表面的anti-CD19(FMC6)scFv特异性结合，这种结合能够被游离的抗CD19的抗体FMC6拮抗。
29cellsweretransfectedwithFMC6-scFvandRFPtag.2xofthecellswerefirstincubatedwithA.HumanFctagcontrol.B.Re