近日，华中农业大学生命科学技术学院严顺平课题组在NaturePlants发表了题为“AnovelWEE1pathwayforreplicationstressresponses”的研究论文，报道了蛋白激酶WEE1调控DNA复制胁迫应答的新机制。该研究不仅完善了WEE1信号通路，而且对利用WEE1抑制剂治疗癌症具有一定的指导意义。值得一提的是，严顺平教授作为通讯作者于年1月15日在NucleicAcidsResearch发表了另一篇相关论文，这两篇论文系统地阐述WEE1激酶调控DNA复制胁迫应答的分子机制（点击这里延伸阅读）。
研究背景
1.DNA复制是所有生物的基本过程。但是很多内源和外源的因素会影响DNA复制，造成DNA复制胁迫。生物体因此进化了精细的复制胁迫应答机制，以保证正确的DNA复制和基因组的稳定性。其中，激活细胞周期检测点是非常重要的机制之一，可以阻止细胞周期进程，使细胞有足够的时间解决复制问题。细胞周期蛋白依赖性激酶CDK是推动细胞周期进程的主要驱动蛋白，其活性会受到复制胁迫的抑制。
2.进化上保守的两个蛋白激酶ATR和WEE1在复制胁迫应答中起关键作用。在动物中，ATR可以激活细胞周期检测点激酶1（CHK1）。被激活的CHK1一方面可以抑制蛋白磷酸酶CDC25，另一方面可以促进WEE1。而CDC25通过去磷酸化CDK激活CDK，WEE1则通过磷酸化CDK抑制CDK。
3.植物具有ATR和WEE1，但是缺少CHK1和CDC25。而且在拟南芥中的研究表明，WEE1不是通过磷酸化CDKA;1（唯一的典型CDK）来发挥作用的。因此，ATR和WEE1在植物中的作用机理尚不清楚。
4.在动物中，突变ATR和WEE1会导致胚胎致死。而拟南芥atr和wee1突变体能正常生长，但是对复制胁迫诱导剂羟基尿（HU）非常敏感。在含有HU的培养基上生长时，atr突变体的主根比野生型显著缩短。这一表型为利用遗传学手段解析ATR的作用机理提供了便利。
主要研究结果
1.作者通过EMS诱变法筛选到一个atr突变体的抑制子soat1，能够抑制atr突变体对HU的敏感性。通过高通量测序和遗传互补实验发现突变基因为FBL17。由于他们发现ATR与FBL17之间没有相互作用，因此推测ATR可能通过WEE1间接地调控FBL17。他们发现突变FBL17确实也可以抑制wee1突变体对HU的敏感性，表明WEE1可能通过负调控FBL17来发挥作用。
图1突变FBL17抑制atr和wee1突变体对HU的敏感性
2.为了探究WEE1如何调控FBL17，作者测试了WEE1与FBL17之间的相互关系。通过Pull-Down实验、免疫共沉淀实验、BiFC实验以及荧光素酶互补实验，他们发现WEE1确实能够与FBL17直接相互作用。
3.鉴于WEE1是蛋白激酶，作者推测WEE1可以磷酸化FBL17。通过体内和体外磷酸化实验，他们发现WEE1能够磷酸化FBL17第99位的丝氨酸残基，而且HU处理会促进FBL17的磷酸化。
4.遗传学证据表明WEE1负调控FBL17，而以前的研究发现FBL17可以通过蛋白酶体途径被降解。因此，作者推测WEE1通过磷酸化FBL17促进其降解。通过泛素化实验和降解实验，作者发现WEE1介导的FBL17磷酸化是其被多聚泛素化和降解所必需的。通过转基因互补实验，他们发现非磷酸化形式的FBL17能够互补atrfbl17双突变体，而模拟磷酸化形式的FBL17则不能，暗示磷酸化形式的FBL17在体内会被降解。
5.以前的研究发现，FBL17通过介导CDK抑制蛋白（CKI）KRP6和KRP7的降解来控制生殖细胞的分裂。因此，作者推测FBL17也通过调控KRP6和KRP7来应答复制胁迫。为了验证这一点，他们在atr和wee1突变体中超量表达KRP6和KRP7，发现超量表达KRP7能抑制atr和wee1突变体对HU的敏感性。此外，他们还发现过量表达另一个CKI蛋白SMR7也可以抑制atr和wee1突变体对HU的敏感性。
6.在人细胞中，E3泛素连接酶SKP2和FBL17有很多相似之处。特别是，有研究发现突变SKP2可以减弱WEE1抑制剂导致的表型。因此，作者想知道人的WEE1是否也可以通过磷酸化负调控SKP2。通过免疫共沉淀实验和Pull-Down实验发现WEE1可以直接与SKP2相互作用。进一步通过体外磷酸化实验和降解实验发现WEE1能够磷酸化SKP2的第64位的丝氨酸残基，并促进其降解。
一图解文
图2WEE1-FBL17-CKI-CDK分子模块调控复制胁迫的工作模型
ATR被复制胁迫激活后会诱导WEE1的表达；作为蛋白激酶，WEE1磷酸化E3泛素连接酶FBL17；被磷酸化的FBL17会进一步被未知的E3泛素连接酶多聚泛素化，并通过26S蛋白酶体被降解；未磷酸化的FBL17促进CKI的多聚泛素化和降解。根据这个模型，在atr和wee1突变体中，FBL17不能被磷酸化，也不能被降解，从而导致CKI被降解；因此，当复制胁迫发生时，CDK仍能活跃地驱动细胞周期进程，细胞没有时间解决复制问题，最终导致复制灾难和严重的根系生长缺陷。在atrfbl17和wee1fbl17双突变体中，CKI不能被多聚泛素化和降解，从而抑制CDK和细胞周期进程，因此细胞有足够的时间解决复制问题，保证根系的正常生长。
研究意义
以前的研究表明，WEE1通过磷酸化CDK直接抑制CDK的活性。与直接抑制模型不同，该研究发现WEE1还可以通过E3泛素连接酶间接抑制CDK。这种间接调控机制在动物中是保守的，对利用WEE1抑制剂AZD治疗癌症具有一定的指导意义。该研究发现了WEE1的新底物FBL17，从而完善了植物的WEE1信号通路，加深了对复制胁迫应答机制的认识。该研究起始于模式植物拟南芥，最终发现了一个在动物和植物中保守的细胞周期调机制，进一步说明了模式植物研究的重要性和优越性。
主要作者介绍
华中农业大学生命科学学院博士后潘婷为本论文第一作者，严顺平教授为通讯作者。严顺平教授于年获浙江师范大学学士学位，年获中国科学院上海植物生理生态所博士学位，随后在美国杜克大学董欣年院士实验室开展博士后研究。年在华中农业大学生命科学技术学院组建实验室，致力于植物DNA损伤应答机理的研究，揭示了染色体结构维持复合体SMC5/6协同调控细胞周期和DNA损伤修复的机制（PNAS,），发现了ATR1-WEE1激酶模块通过抑制RNA剪接调控复合体MAC应答复制胁迫的机制（NucleicAcidsResearch,）。
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