TUhjnbcbe - 2023/7/19 20:41:00
<实验目的:构建Cas9-KRAB融合蛋白表达载体,与靶向性sgRNA共转染细胞,下调靶基因的转录表达。实验原理:Cas9蛋白与sgRNA识别并定位到靶基因的启动子区域,KRAB转录抑制域阻断转录相关蛋白的招募,抑制RNA聚合酶的活性,下调靶基因的转录。实验材料:Cas9-KRAB表达载体、sgRNA表达载体、cible细胞等。实验步骤:1.设计靶向性sgRNA,定位于靶基因的启动子上游区域;2.构建Cas9-KRAB融合蛋白表达载体,实现其在cible细胞中的稳定表达;3.构建sgRNA的表达载体,转染至cible细胞;4.将Cas9-KRAB表达载体与sgRNA表达载体共转染至cible细胞;5.提取RNA,通过qRT-PCR检测靶基因表达量的变化;6.westernblot检测靶基因产物的表达变化。实验结果:qRT-PCR和westernblot显示,与对照组相比,靶基因在mRNA和蛋白水平的表达显著下调。研究意义:CRISPRi为研究基因功能提供简便高效的工具,但技术的特异性与持续性还需提高。未来展望:CRISPRi可应用于肿瘤抑制基因的功能研究,有潜力发展为新型的基因治疗方案。但在转化应用前,同样需要严密考虑其对非靶基因的影响,并优化提高其技术精准度与安全性能。名称：重组CRISPR-Cas9蛋白规格：/pmol表达系统：E.coli价格：/0存储条件：-20°C产品介绍：来自S.pyogenes的Cas9核酸酶是依赖于RNA介导的内切核酸酶，可以特异地切割双链DNA（在DNAPAM存在的情况下，也可以切割单链DNA或单链RNA）。Cas9切割位点位于目标序列（targetsequence）内，离PAM（NGG）区3个碱基。PAM对于Cas9的识别和切割都是必需的。因为反应需要添加RNA（sgRNA或者crRNA:tracrRNA），整个体系，包括Cas9酶都不能含有任何RNase活性。其中，Cas9中的HNH和RuvC结构域分别负责切割靶标DNA中与sgRNA配对和非配对的链。在本产品中，Cas9的H和D10都被突变为A，使Cas9的HNH和RuvC结构域均失活，获得dCas9蛋白。因此，dCas9只有结合靶标DNA的活性，而没有切割靶标DNA的活性