写在前面
今天推荐的是由天津医科大学生物化学与分子生物学系在年5月16日发表于JournalofClinicalInvestigation（IF：12.，JCR1区）的一篇文章，通讯作者是LeiShi教授，研究表明USP7稳定组蛋白去甲基化酶PHF8促进乳腺癌的发生。
研究背景
组蛋白的翻译后修饰是通过各种酶促反应完成的，在真核细胞的染色质结构和功能中起着重要作用。组蛋白去甲基化酶PHF8与多种病理疾病有关，包括X连锁智力低下和肿瘤发生。然而，目前还不清楚PHF8的丰度和功能是如何被调节的。
摘要部分
在这里，作者研究了PHF8与去泛素化酶USP7的物理联系。具体来说，作者证明了USP7促进了PHF8的去泛素化和稳定化，导致了一组基因的上调，包括细胞周期蛋白A2，这些基因对细胞生长和增殖至关重要。编码USP7的基因也通过正反馈受到PHF8的转录调节。USP7在乳腺癌中过度表达，其表达水平与PHF8和细胞周期蛋白A2的表达以及乳腺癌的组织学等级呈正相关。作者表明，USP7通过稳定PHF8和上调细胞周期蛋白A2来促进乳腺癌的发生，并且USP7和PHF8之间的相互作用在DNA损伤期间得到增强。此外，USP7促进的PHF8稳定使细胞对基因*性损伤具有抵抗力，并且是招募BLM和KU70的必要条件，这两者对DNA双链断裂修复都是必不可少的。作者的研究从机制上将USP7与表观遗传调节和DNA修复联系起来。此外，这些数据支持将USP7和PHF8作为乳腺癌干预的潜在目标，特别是与化疗或放疗结合使用。
研究内容
1.组蛋白去甲基化酶PHF8与去泛素酶USP7有物理联系
首先，作者构建稳定表达多西环素诱导（Dox-inducible）整合的FLAG-PHF8的MCF-7细胞。产生了一个乳腺癌MCF-7细胞系，允许多西环素诱导（Dox-inducible）表达稳定整合的FLAG-PHF8。通过收集细胞提取物并进行蛋白质谱分析，作者发现，PHF8与一些蛋白质相关，包括BLM、OGT和HSPA8。蛋白质去泛素酶的成员USP7也被确定在含PHF8的蛋白质复合物中，并通过免疫共沉淀实验和蛋白质分馏实验等证明两者确实发生相互作用。
图1.Usp7促进Yorkie（Yki）靶基因的表达
研究结论：去泛素化酶USP7与组蛋白去甲基化酶PHF8有相互作用。
2.USP7在功能上与PHF8的稳定有关
为了解决USP7和PHF8之间的物理互动和空间共定位的功能意义，作者研究了USP7对PHF8表达的影响。USP7被敲低或敲除后PHF8的水平在不同细胞株中明显降低。此外，USP7敲低下PHF8蛋白表达的减少并不是因为PHF8mRNA减少，PHF8蛋白水平的降低可能是通过蛋白酶体介导的蛋白降解机制，因为该效应可被蛋白酶体特异性抑制剂MG有效阻断。这些观察结果表明，PHF8的稳定性是由USP7调节的，PHF8是USP7的底物。
图2.USP7促进PHF8的稳定
研究结论：USP7控制PHF8稳定性。
3.USP7使PHF8去泛素化
作者接下来研究是否是USP7催化的PHF8去泛素化的结果促进PHF8的稳定。为此，作者产生了两个稳定的MCF-7细胞系，分别具有Dox诱导表达的野生型USP7（USP7/WT）和USP7的催化无活性突变体（USP7/CS）。通过免疫印迹分析，在表达USP7/WT的细胞中，PHF8的蛋白水平以Dox剂量依赖的方式急剧增加，而在表达USP7/CS的细胞中，没有检测到PHF8蛋白水平的明显变化。
不仅如此，通过稳定表达FLAG-PHF8的HeLa细胞与Myc-USP7和HA标记的野生型泛素（Ub/WT）或所泛素突变体（Ub/mt）共转染，并用抗FLAG对细胞裂解液进行IP检测，然后用抗HA进行IB检测，结果显示Myc-USP7表达的增加与泛素化PHF8物种水平的降低有关。
图3.USP7使PHF8去泛素化
研究结论：USP7以PHF8为目标进行去泛素化，证实组蛋白去甲基化酶PHF8是去泛素化酶USP7的真正底物的观点。
4.USP7促进PHF8稳定的生物学功能
为了了解USP7促进PHF8去泛素化和稳定的生物学意义，作者通过高通量RNA深度测序（RNA-seq）研究了PHF8或USP7缺失的MCF-7细胞的转录组。对PHF8和USP7缺失细胞的转录组进行交叉分析，发现有个基因的表达在PHF8和USP7缺失的细胞中都发生了改变，这些基因被认为是被PHF8和USP7核心调节的目标。然后，通过KEGG路径分析，将被USP7和PHF8核心调控的基因归入各种信号通路，结果表明，敲除USP7或PHF8后，CCNA2、TGFB2、DEPDC1B和CCNE2的mRNA水平下降，但BRCA1和CP的mRNA水平没有下降。
此外，为了确定这些基因是否被PHF8直接锁定，作者在稳定表达FLAG-PHF8的MCF-7细胞中，通过定量染色质免疫沉淀（qChIP）检测PHF8对这些基因启动子的占用情况。结果显示，与H3K4me3相似，在CCNA2、TGFB2、DEPDC1B、CCNE2和USP7的启动子区域检测到FLAG-PHF8的招募。此外，MCF-7细胞的ChIP检测也检测到内源性PHF8在这些基因启动子上的占用，这些结果表明，CCNA2、TGFB2、DEPDC1B、CCNE2和USP7确实被PHF8锁定，说明USP7本身通过正反馈受到PHF8的转录调节。
以前的研究表明，USP7是一种染色质修饰剂，作用是去除组蛋白H2B赖氨酸单泛素化（H2BKub1）。因此，USP7有可能通过去泛素化H2BKub1，与PHF8协调，影响基因的激活。为了验证这一点，作者进行了qChIP实验，并在MCF-7细胞中检查了USP7对上述PHF8目标基因的招募情况。作者没有检测到USP7在CCNA2、DEPDC1B、TGFB2和CCNE2基因启动子上的占用。Westernblotting结果显示，在表达USP7/WT而不是USP7/CS的细胞中，由CCNA2编码的细胞周期蛋白A2的蛋白水平以Dox剂量依赖的方式急剧诱导。
图4.USP7和PHF8对细胞周期蛋白A2的表达起核心作用
研究结论：USP7通过稳定PHF8来调节PHF8靶基因的表达，从而在上游发挥作用。
5.USP7/PHF8/cyclinA2轴促进乳腺癌细胞的体外增殖和体内乳腺癌的发生
细胞周期蛋白A2的失调与错误的细胞增殖和染色体不稳定有关，而且细胞周期蛋白A2的异常表达与多种类型的恶性肿瘤有关，包括乳腺癌、肝癌和肺癌。鉴于作者观察到USP7介导的PHF8的去泛素化和稳定调节了细胞周期蛋白A2的表达，有理由推测USP7/PHF8信号通路在细胞增殖和致癌中起作用。为了验证这一假设，作者首先用人体组织阵列分析了USP7、PHF8和细胞周期蛋白A2的蛋白表达水平。免疫组化染色显示所有USP7、PHF8和细胞周期蛋白A2在来自乳腺、结肠和直肠的癌肿中都有上调。然后，作者通过免疫组化染色，用包含个样本的人类组织阵列分析了USP7、PHF8和细胞周期蛋白A2的表达谱。作者发现，根据免疫阳性的平均强度和核染色范围进行分析时，USP7和PHF8与细胞周期蛋白A2一起在乳腺癌样本中高度表达，它们的表达水平与乳腺癌的组织学等级密切相关。这些结果与作者在免疫组化染色中观察到的蛋白表达概况一致，并支持USP7本身通过正反馈受PHF8转录调节的论点。
为了进一步确定USP7/PHF8/cyclinA2在细胞增殖和乳腺癌发生中的作用，作者移植了5种乳腺肿瘤分别感染不同的病*组合。在接受移植了USP7或PHF8细胞的无胸腺小鼠中，肿瘤的生长被大大抑制。同时，在USP7缺陷的肿瘤中过度表达PHF8或在PHF8缺陷的肿瘤中获得细胞周期蛋白A2的功能可以恢复乳腺肿瘤的生长。
图5.USP7/PHF8/cyclinA2信号通路促进乳腺癌的发生
研究结论：USP7/PHF8/cyclinA2轴在促进乳腺癌发生中发挥作用。
6.USP7促进的PHF8稳定在DNA损伤反应中进行
USP7被确定为DNA损伤反应（DDR）在维护基因组完整性和提供DNA损伤耐受性方面的一个关键调节器。因此，作者测试了基因*性侵染是否会对USP7促进的PHF8的稳定有任何影响，以及USP7/PHF8信号通路本身是否参与了DDR。为此，首先将MCF-7细胞暴露于6-Gy剂量的X射线照射（IR）。结果显示，PHF8的蛋白水平在IR处理后有所增加。同样，当MCF-7细胞被仿辐射DNA损伤剂新卡西诺丁（NCS）处理时，PHF8的蛋白水平也升高了。然而，qRT-PCR分析显示，对照组MCF-7细胞和暴露于IR或NCS的细胞中PHF8mRNA的水平是相当的。这些结果表明，当细胞暴露于DNA损伤时，PHF8的丰度在转录后水平上受到正常调节，这一过程涉及USP7。
USP7和PHF8之间的物理互动和功能联系受到DNA损伤的影响。为了研究USP7对PHF8的DDR增强稳定的功能意义，作者进行了多色竞争实验。研究发现敲除USP7使MCF-7细胞对IR更敏感。此外，USP7的敲除也使MCF-7细胞对NCS敏感。同时作者证明PHF8缺乏的细胞在受到基因*性伤害时也会明显受到损害。
图6.USP7促进的PHF8稳定参与了DNA损伤反应
研究结论：USP7促进的PHF8稳定化在DDR中得到了关键性的作用。
7.双链断裂修复需要USP7促进的PHF8稳定化
为了进一步了解USP7促进的PHF8稳定化在DDR中的作用，作者研究了PHF8是否直接参与断裂修复。作者发现在4-羟基塔莫西芬处理激活AsiSI后，PHF8被招募到断裂近端部位。这些结果表明，PHF8在DNA损伤时被动员并被招募到DSB位点。
为了解决在DSB位点招募PHF8的功能意义，作者研究了PHF8对两个主要DSB修复途径--同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）的修复效率的影响。PHF8的敲除导致HR效率的明显降低，同时，通过计算发现PHF8的敲除与GFP阳性细胞的百分比降低有关。这些实验共同表明，PHF8是哺乳动物细胞中有效的NHEJ和HR修复DSBs所必需的。
接下来，作者探究PHF8的去甲基化酶活性是否是其参与DNA修复的必要条件。为此，将内切酶I-SceI与针对PHF8mRNA的3′-UTR的siRNA共同转染到稳定表达野生型PHF8（PHF8/WT）或去甲基化酶活性缺陷的PHF8（PHF8/HA）的DR-GFPU2OS细胞。FACS分析显示，PHF8/WT能够恢复由内源PHF8敲除引起的HR修复效率下降，而PHF8/HA则不能。
图7.USP7促进的PHF8稳定化是DSB修复所必需的
研究结论：双链断裂修复需要USP7促进的PHF8稳定化。
8.USP7促进的PHF8稳定化是招募BLM和KU70所必需的
为了对USP7促进的PHF8稳定在DDR中的作用有更多的机理了解，并解决PHF8在DSB位点招募的功能影响，作者接着探究PHF8是否能影响关键DDR蛋白在断裂区的招募。
作者证明PHF8的缺乏与BLM对紫外激光诱导的DNA病变的招募受损有关，通过一系列实验表明BLM可以有效地与内源性PHF8或PHF8/WT共同免疫沉淀，但PHF8/HA则不能。因此，作者推断，去甲基化酶的活性是PHF8准备一个特定的DDR成分所必需的。为了证实PHF8在DNA末端切除中的作用，作者检查了单链DNA结合（ssDNA结合）蛋白RPA的磷酸化，发现在PHF8敲除后，DNA损伤引起的RPA32的Ser-4和Ser-8的磷酸化明显减少。这些数据表明，PHF8的功能是通过介导BLM的招募来促进DNA末端的切除。
为了确定PHF8如何有助于NHEJ的修复，作者用紫外线激光微辐照实验来监测KU70（一种DNA末端结合蛋白）的积累动力学。实验发现PHF8的敲除与KU70的招募受损有关。与PHF8通过其催化活性促进NHEJ修复的观察一致，PHF8/WT，而不是PHF8/HA，能够回补PHF8缺陷的细胞中KU70招募受损的表型。
与PHF8对DDR因子在DSB上的积累的影响相一致，作者还发现USP7的敲除破坏了BLM、RPA32磷酸化和KU70在断裂位点的积累。
图8.PHF8促进BLM和KU70在DSBs的积累
图9.USP7促进的PHF8稳定化是DSB修复所必需的
研究结论：PHF8是一个新的DSB修复模块，它分别通过HR或NHEJ途径促进BLM或KU70的招募和高效的DSB修复。
结论与讨论
作者证明了组蛋白去甲基化酶PHF8与去泛素酶USP7有物理联系并被其稳定。表明USP7在乳腺癌中是上调的，其表达水平与PHF8相关。与观察到的USP7促进PHF8的稳定与细胞周期蛋白A2的上调相一致，表明在临床乳腺癌样本中，细胞周期蛋白A2的表达水平升高，并与PHF8和USP7的表达水平呈正相关。此外，还证明细胞周期蛋白A2的功能增益能够回补PHF8敲除引起的体外和体内表型。总之，这些发现为理解乳腺癌中细胞周期蛋白A2的失调提供了分子基础。
Thankyou!
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