染色质免疫共沉淀技术（ChIP）
基于体内分析而发展的染色质免疫沉淀分析（Chromatinimmunoprecipitationassaykit,ChIP）技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管病以及中央神经系统紊乱等疾病主要通路的一种非常有效的工具。染色质免疫沉淀分析（ChIP）的基本原理是在活细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质－DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。今天小编将珍藏多年的ChIP实验心得拿出来与大家一同探讨。应用领域1、判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰2、检测RNApolymeraseII及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位3、研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系4、转录因子研究技术流程
案例展示案例一题目：HypoxiainducesH19expressionthroughdirectandindirectHif-1αactivity,promotingoncogeniceffectsinglioblastoma期刊：scientificreports主要内容：作者分别使用了两种细胞U87和U，验证SP1对于H19的转录调控作用。用SP1抗体进行ChIP实验，对H19的启动子区域上游bp的高GC含量，设计引物。富集到的DNA进行qPCR检测，结果显示SP1能够调控H19启动子的转录。
案例二题目：ChromatinProfilingbyDirectlySequencingSmallQuantitiesofImmunoprecipitatedDNA.期刊：NatMethods主要内容：收集培养的5×K细胞，使用组蛋白甲基化修饰抗体H3K27me3、H3K4me3、H3K36me3（ChIP-grade）进行IP富集提取的经过片段化的染色质复合物，构建测序文库后进行二代测序，获得peaks在染色质上的分布情况。
案例三题目：AcrucialrolefortheubiquitouslyexpressedtranscriptionfactorSp1atearlystagesofhematopoieticspecification.期刊：Development主要内容：分离培养小鼠胚胎干细胞并诱导分化，分别收集组细胞及Flk+细胞，用转录因子Sp1抗体进行ChIP实验后二代测序，获得Sp1结合位点在两种细胞中的分布区域。
ChIP经验分享ChIP实验操作性很强，金开瑞根据多年的实践，总结了一些ChIP实验中您可能会遇到的棘手的问题，下面我们就一起来康康吧！细胞固定1、甲醛终浓度为1%较适宜2、固定时间一般为5-60min较好，具体时间根据实验而定染色质断裂1、超声时断时续，保证低温2、注意探头位置，防止产生泡沫3、研究组蛋白需使用酶处理染色质免疫沉淀1、最好有Input对照。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。2、抗体的选择是关键。抗体的选择要注意三点：一是应该选择能够做ChIP实验的抗体。尽量选择ChIP级别商业化的抗体。如没有，一般可以重组到带有标签的载体上，再转染相应的宿主（目前市面上商业化的chip抗体只有多种，因此正好找到对应抗体较困难，可以选择标签抗体）。二是抗体的结合位点。选择单抗的话，尽量远离抗原和染色质相结合的位点，这样可以最大限度保证抗体和抗原的结合，而多抗可识别多个表位，可基本避免该风险。因此单多抗各有优缺点，应重点