1、哺乳动物Cre-LoxP表达载体
2、哺乳动物CRISPR/Cas9基因编辑载体
1、哺乳动物Cre-LoxP表达载体
概述：常规质粒基因表达载体系统利用LoxP-Stop-LoxP（LSL）表达盒，在哺乳动物细胞和动物体内实现Cre介导的条件性基因激活表达。LSL表达盒包含三个重复的SV40polyA，序列两端为LoxP位点。用户选择的启动子位于LSL表达盒的上游，而用户感兴趣的基因位于其下游。在Cre重组酶不存在的情况下，该表达盒完全阻断了目的基因的正常表达；当将Cre引入携带该载体的细胞中时，目的基因上游的LSL表达盒将会被删除，从而目的基因能够在用户选择的启动子下被永久激活表达。
该载体不仅适用于体外细胞培养，更适用于转基因动物模型的构建。当携带这种载体的转基因动物与携带组织特异性表达Cre的转基因动物杂交时，产生的动物后代将在特定的细胞中组织特异性表达Cre，从而启动目的基因在该特定细胞中组织特异性表达。
在细胞培养中使用该载体系统时，可将抗生素或荧光标记添加到载体中，使转染后的细胞可被筛选或可示踪以便于分离出已永久整合载体的细胞。
该载体是为在哺乳动物细胞和动物体内实现Cre介导的条件性基因表达而设计的。目的基因的表达最初是沉默的，但通过与Cre重组酶的共表达后，目的基因上游的3xSV40pA（上图中的STOP基因）将会删除，从而目的基因能够在用户选择的启动子下被永久激活表达。
优势
基因的稳定激活：经过Cre重组酶处理后，阻断下游基因转录的3xSV40pA将被永久删除，随后客户选择的启动子能够驱动的目的基因的正常表达。
技术简单：常规转染即可把质粒转入细胞，相比起病*载体需要进行病*包装，过程更简单。
载体容量非常大：载体总容量可达30kb，其中质粒骨架只占3kb，有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。
高水平表达：常规质粒转染细胞后，可以产生非常高的拷贝数（每个细胞多达几千拷贝），使外源基因能高水平表达。
适用于体内应用：该载体不仅拥有良好的体外细胞转导能力，更适用于体内活体动物实验，如Cre介导的条件性基因表达转基因动物。
不足之处
载体DNA非整合型：常规质粒在细胞里主要以游离DNA状态存在，所以常规质粒转染也称为瞬时转染。然而，质粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因组中（质粒转染每10的2次方~10的6次方个细胞可能会有一个细胞的基因组被整合，整合效率取决于细胞类型）。如果将携带了药物抗性基因或者荧光标记基因的载体转到细胞中，在经过扩大和传代培养后，可以使用药物筛选或细胞分选来获得稳定整合了该载体的细胞。
可转染的细胞类型受限：不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染，原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染，如神经元和胰岛β细胞。另外，质粒转染局限于体外细胞实验，很少运用到活体实验。
基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性：尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数，但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中，质粒拷贝数非常高，而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。而病*转导更倾向于相对均匀地把基因转到细胞中。
质粒图谱及组成元件：以过表达mIL2为例，荧光蛋白选择EGFP
2、哺乳动物CRISPR/Cas9基因编辑载体
概述：CRISPR/Cas9（规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9）核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一（另外两种是ZFN和TALEN），可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA，能够引导DNA核酸酶（或缺刻酶）编辑基因组中特定位点的DNA序列。
Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用，CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引导RNA（gRNA）。
CRISPR/Cas9表达载体中有两种Cas9核酸酶供选择，一种是标准的人源化Cas9（hCas9），能够有效地在靶位点产生双链断裂（DSBs）；另一种是“缺刻酶”（Cas9_D10A），仅在DNA中产生单链切割。如果将Cas9_D10A缺刻酶与靶向两条互补链的两个gRNA一起使用，缺刻酶会在两条链上产生单链切割，从而导致靶位点处产生DSB。这种方法通常会减少CRISPR/Cas9脱靶效应，因为它需要两个gRNA同时靶向靶位点。
细胞通过非同源末端连接途径（NHEJ）修复通常会产生小的片段或碱基缺失，插入和碱基置换等突变。当这些突变破坏蛋白质编码区（例如引起移码缺失）时，会引起功能性基因敲除。在少数情况下，CRISPR/Cas9载体和外源供体DNA模板共同导入细胞时，细胞会通过同源性修复（HDR）机制来修复DSB，靶基因DNA序列会被模板序列取代，碱基发生改变，如点突变等。缺刻基因组DNA也会经常发生同源修复（HDR），如将外源模板DNA与Cas9_D10A缺刻酶一起导入细胞中，有可能产生碱基改变。
利用CRISPR/Cas9系统可以有效靶向大部分DNA序列，而NGG（有时是NAG）是必须的。NGG叫做前间区序列邻近基序（PAM），位于靶DNA，gRNA识别序列的3末端。
优势
瞬时表达：转染CRISPR/Cas9质粒载体后，Cas9蛋白和gRNA会在靶细胞中大量瞬时表达。如果没有药物筛选，质粒会随着时间流逝而丢失，在基因组编辑发生后，靶细胞中的Cas9和gRNA也会逐渐消失。
简单易懂：gRNA和靶位点之间的简单同源关系使得CRISPR/Cas9系统简单且易于设计。
不足之处
具有脱靶效应：已有文献报道CRISPR/Cas9具有脱靶效应，通常TALEN系统比CRISPR/Cas9具有更低的脱靶活性。通过将Cas9_D10A缺刻酶与两种gRNA结合使用（如上所述），可以显著减轻脱靶效应。
PAM要求：CRISPR/Cas9靶位点必须包含NGG序列（使用较多），也叫做PAM序列，位于gRNA识别序列3末端。
质粒图谱及组成元件：以靶向hIL2为例，荧光蛋白选择EGFP
未设计donor
gRNA设计要点
gRNA分子由一个短的引导序列和一个Cas9蛋白结合所必须的Scaffold序列组成。gRNA分子的引导序列需与靶序列的下链完美互补，且靶序列后需跟着一个被Cas9蛋白识别的PAM序列才是有效的靶序列。SpCas9蛋白识别的PAM序列是5-NGG-3或者5-NAG-3（此处N代表任一核酸碱基）。选择5‘-NNGG-3或者5‘-NNAG-3这样的序列作为有效靶序列，将前18～22个碱基作为引导序列与gRNAscaffold序列组成完整的gRNA序列。
（通常为20nt，请注意不要输入PAM序列）
hIL2[gRNA#15]：
GTGAGCATCCTGGTGAGTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC
(20bp)
Scaffoldsequence(specificforSpCas9)(76bp)
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