实验步骤及技巧
一、A人黑色素瘤细胞复苏
1.准备工作
（1）检查液氮罐中的细胞冻存管，确保冻存管标签清晰，无明显损坏。
（2）准备必要的培养基和试剂，包括DMEM培养基、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液、0.25%胰酶/EDTA消化液、PBS缓冲液等。
（3）准备必要的实验器材，包括培养箱、细胞培养瓶、移液器、显微镜、离心机等。
2.细胞复苏
（1）从液氮罐中取出A黑色素瘤细胞冻存管，立即放入37℃水浴中解冻，迅速将细胞悬液转移到50ml离心管中。
（2）将细胞悬液加入10mlDMEM培养基中，轻轻振荡混合，并离心5min，弃去上清液。
（3）加入10mlDMEM培养基和10%胎牛血清，将细胞悬液分装到3个25cm2细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
（4）观察细胞的生长情况，通常在24小时内开始出现细胞附着生长。继续培养，定期观察细胞的形态和数量。
技巧：解冻时需要迅速操作，尽量避免细胞的暴露在室温环境中时间过长，以免细胞受到冷冻损伤。同时，培养瓶的预处理也非常重要，应该在培养前用70%酒精消*，并彻底清洗干净，避免细菌污染。
二、A人黑色素瘤细胞培养
1.培养基制备
（1）DMEM培养基的制备：将DMEM粉末溶解于无菌的去离子水中，加入10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液，加热灭菌。
（2）PBS缓冲液的制备：将PBS缓冲液粉末溶解于去离子水中，调节pH值至7.4，滤过灭菌。
2.细胞培养
（1）将A黑色素瘤细胞分装到不同大小的细胞培养瓶中，根据细胞数量和需要的实验量进行调整。
（2）加入DMEM培养基和10%胎牛血清，放入37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
（3）定期更换培养基，为细胞提供充足的营养物质和生长因子，促进细胞生长和分裂，维护细胞的健康状态。
（4）定期观察细胞的形态和数量，避免细胞污染和感染。
技巧：细胞培养的温度、湿度和气体环境非常重要，需要严格控制。同时，定期更换培养基可以避免细胞的营养不足和废物积累，促进细胞的生长和分裂。
三、A人黑色素瘤细胞传代
1.细胞分裂检测
（1）观察细胞的生长状态，当细胞密度达到80%～90%时，说明细胞已经达到密集生长状态，此时需要进行传代。
（2）用显微镜观察细胞形态，如果细胞正常生长、细胞质丰富、核染色体清晰可见，则说明细胞状态良好，可以进行传代。
2.细胞传代
（1）将细胞培养液转移到离心管中，离心5min，弃去上清液。
（2）加入0.25%胰酶/EDTA消化液，放入37℃的恒温水浴中消化细胞。消化时间根据细胞种类和生长状态而定，一般为5～10min。
（3）向消化细胞的离心管中加入培养基，离心5min，弃去上清液。
（4）将细胞悬液接种到新的细胞培养瓶中，加入新的培养基和10%胎牛血清，放入培养箱中进行培养。
（5）定期更换培养基，以维持细胞的生长和分裂，避免细胞的老化和死亡。
技巧：传代时需要注意细胞的生长状态和消化时间，过长或过短的消化时间都会对细胞产生不良影响。同时，新的细胞培养瓶也需要事先消*和清洗，避免细菌污染。
四、A人黑色素瘤细胞冻存
1.细胞冻存液制备
（1）将A黑色素瘤细胞培养液离心5min，弃去上清液。
（2）加入5ml冻存液，混合均匀，转移到冻存管中。
（3）将冻存管标记清晰，存放于液氮罐中冻存。
2.细胞冻存过程
（1）将细胞培养瓶移至37℃的恒温水浴中，加入0.25%胰酶/EDTA消化液，放置5～10min。
（2）将消化液转移到离心管中，离心5min，弃去上清液。
（3）加入培养基，将细胞悬液转移到冻存管中。
（4）将冻存管标记清晰，存放于液氮罐中冻存。
技巧：细胞冻存液的制备需要注意冻存液的成分和浓度，以保证细胞的存活率和冻存后的质量。同时，细胞冻存过程也需要严格控制，避免细胞受到冷冻损伤或细菌污染。
总结
A人黑色素瘤细胞的复苏、培养、传代和冻存是细胞学研究中的基本操作，也是黑色素瘤研究的重要环节。在实验过程中，需要严格控制细
参考文献：
USP22deficiencyinmelanomamediatesresistancetoTcellsthroughIFNγ-JAK1-STAT1signalaxis(/02/15)
作者：MinLi,YanqinXu,JieLiang
期刊：MolecularTherapy