一、实验目的
学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。了解倒置显微镜的构造并掌握其使用方法。能够辨别死、活细胞。二实验原理
死活细胞鉴别有许多不同的方法，其中最常用方法是台盼蓝染色排除法。其原理是：许多酸性染料不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。
荧光染色排除法
活细胞有较强的酯酶活性，可将二丙酸酯荧光素中的荧光素分解出来，从而使细胞发出强绿色荧光。活细胞*绿色，死细胞无色。
三、试剂与器材
1.材料：兔耳尖皮肤
2.试剂：1％台盼蓝溶液（生理盐水配制）、PBS、0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA(质量与体积百分比)、完全培养基。
台盼蓝溶液3.器材：超净工作台、倒置显微镜、冷冻离心机、手术刀、眼科剪、眼科镊子、离心管、培养瓶等。
四、实验内容
1.兔成纤维细胞的制备
无菌条件下取兔耳尖皮肤。
剪切组织块至约1mm3大小。
消化。
制成细胞悬液。
2.染色制片
取1mL磷酸盐缓冲液/生理盐水，加入5uL全血，滴入2滴台盼兰染液。
静置5min。
制成临时装片，镜检。
3.结果
死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
细胞计数：血细胞计数板
血细胞计数板细胞活力公式
根据下式求细胞活力：
活细胞率（％）＝（细胞总数-死细胞数）/细胞总数×％
五、注意事项
1.计数时应多选择几个视野，以多个视野内的平均值作为细胞的存活率。
2.细胞分离过程需无菌操作，以免因细胞分离时间过长而导致细胞死亡。
3.以台盼蓝排除法在倒置显微镜下计数死活细胞数目需注意染色时间。
六、作业与思考
1.计数死活细胞数，计算出细胞存活率。
活细胞率（％）＝（细胞总数-死细胞数）/细胞总数×％
2.为什么台盼蓝作用一段时间后，细胞的存活率会变低？
死细胞的细胞膜无屏障作用，台盼蓝马上进入细胞而显蓝色。活细胞细胞膜有选择透性，对台盼蓝的透性小，进入细胞慢。若染色时间过长，台盼蓝可能通过胞吞或胞饮作用进入细胞。
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