在生物学研究中,活/死细胞染色试剂是一种非常重要的工具,它可以帮助我们区分活细胞和死细胞。这种试剂可以通过染色细胞膜上的磷脂来达到区分的目的。
细胞增殖和细胞死亡间平衡的维持对多种细胞有机的发育与生命的维持至关重要,其失衡将导致各种疾病的发生.如:人类平均每天有6×10(10)个新细胞生成,同时又接近同等数量的成熟细胞被机体清除.在细胞增殖及细胞凋亡间存在一种配对关系,因此区分活细胞和死细胞对研究生长条件的控制和细胞死亡过程都是十分重要的。
一.试剂准备:
A.活细胞-绿色染料(LiveDye):冰上避光放置。
B.死细胞-红色染料(NucleiDye):冰上避光放置。
C.实验缓冲液(10×)[AssayBuffer(10×)]:用ddH20稀释10x实验缓冲液,至1x实验缓冲液(工作液)。使用前预热到37C。
D.染色工作液:每1ml的实验缓冲液(1X)中,加入1ul活细胞-绿色染料(LiveDye)和1ul死细胞-红色染料(NucleiDye),混合均匀(适用于2个样品孔,每孔0.5ml)。如有大量样品,请成比例的扩大染色工作液配置。
二.(一)荧光显微镜:
1.用预期的方法处理细胞,在不含诱导剂条件下孵育细胞建立阴性对照组;
2.对于贴壁细胞,在24孔板的盖玻片上种植和培育细胞,在CO2细胞培养箱中37°C培养至少24小时。先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞,之后离心收集细胞(rpm,3min)。
对于悬浮细胞,直接离心(4℃,g,5min)收集细胞。
3.用PBS洗涤细胞两次,移除液体。
4.在24孔板中,每个孔加入0.5ml染色工作液来,37℃避光孵育15-30min。
5.用PBS洗涤细胞两次。
6.将盖玻片覆盖到载玻片上,尽快使用适当的滤光片通过荧光显微镜分析细胞。
为了获得更佳效果,可以使用抗荧光淬灭剂对其进行观察。
(二)流式细胞分析:
1.用预期的方法处理细胞
对于所有的处理和未处理的细胞样本,建议把未染色的对照组细胞悬浮在实验缓冲液(不含有LiveDye和NucleiDye),用于流式细胞分析;
2.对于非贴壁细胞,收集1-5×个细胞离心(4℃,g,5min),用预冷的PBS洗涤2次,弃去PBS。对于贴壁细胞,先用胰蛋白酶(不含EDTA)消化细胞,然后离心去上清。
3.用ul染色工作液来悬浮细胞。
4.避光孵育15-30min。
5.使用流式细胞仪进行相应检测与分析。