上期流式课堂，大家了解了调节性T细胞（Treg）的研究基础。本期，小E为大家精心整理了Treg鉴定方案，供大家参考。
小鼠调节性t细胞(Treg)鉴定步骤配色方案小鼠调节性t细胞(Treg)鉴定所需流式抗体小鼠调节性t细胞(Treg)鉴定所需辅助试剂样本管设置实验步骤一、小鼠脾细胞分离步骤：
01
取小鼠脾脏，置于PBS中；
02
可用注射器柱塞研磨脾脏，并通过70μm细胞过滤器过滤，收集滤液到15mL离心管；
03
g离心5min，弃上清，得到红色细胞沉淀；
04
加2mL1x红细胞裂解液，重悬沉淀，室温下裂解2~3min，再加10mLPBS，终止裂解反应；
05
g离心5min，弃上清，得到白色细胞沉淀，用细胞染色缓冲液重悬细胞，并做细胞计数，调整细胞浓度为1×/mL。
二、细胞固定破膜实验步骤：
（下面是全染管的实验步骤，空白组不加抗体，单染管只在对应步骤加对应流式抗体，同型对照组将相应的流式抗体替换成同型对照，所有组都要固定破膜）
01
根据检测的量，稀释Foxp3检测专用的固定剂和破膜剂；
02
取μL小鼠脾脏细胞（1×个细胞），置于流式管内，加入1Test的FITCAnti-MouseCD4（E-AB-FC）和1Test的APCAnti-MouseCD25（E-AB-FE）混匀，4℃孵育30min；
03
孵育完毕后，加入1mL细胞染色缓冲液，g离心5min，弃上清，再加入μL细胞染色缓冲液，重悬细胞；
04
加入1mL固定剂，涡旋混匀，4℃反应30min；反应完成后，g离心5min，弃上清；
05
加入2mL破膜剂，涡旋混匀，g离心5min，弃上清；
06
重复步骤5；
07
加入μL破膜剂，重悬细胞，再加入PEAnti-MouseFoxp3（E-AB-FD），混匀后室温孵育30min；
08
加入2mL破膜剂，g离心5min，弃上清；
09
加入μL细胞染色缓冲液，重悬细胞，即可上机检测。
实验结果小鼠脾脏Treg细胞表型分析解析：荧光素间有溢漏，故需要设置单阳管，用于调节补偿；
CD4分群明显，无需同型对照；CD25和Foxp3分群不明显，需同型对照；
本实验取正常小鼠脾脏验证，无生物学对照；
圈门路径：
首先，根据FSC-A和SSC-A圈中目的细胞；
其次，利用光散射特性，去黏连，得到单细胞；
再次，通过CD4，确定CD4+辅助T细胞；
最后，通过CD25+/Foxp3+，确定出Treg细胞亚群。
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