水凝胶是由交联的多聚链或复杂的天然或合成蛋白分子组成的网络构成。由于含大量水，水凝胶具有和天然组织非常相似的生物物理学特性，因而可以作为高效的3D细胞培养基质。水凝胶可以单独或和其他技术（如固体支架、可通透支持物、细胞微阵列和微流体设备）联用。
在3D培养系统中水凝胶有多种使用方法：包括为固体支架在内的多种细胞培养表面做包被，也可以将细胞包裹或夹在基质中间。水凝胶基质中细胞的形态、生长和功能取决于生物物理学和生物化学特性，以及如通透性和基质硬度在内的物理特性。
天然来源的细胞培养水凝胶通常由蛋白和ECM成分（如胶原、层纤连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、壳聚糖或CorningMatrigel基质）构成。由于来源于天然成分，存在多种有助于多种细胞存活、增殖、功能实现和发育的内源因子，这些凝胶本身具有生物兼容性和生物活性，有利于细胞功能的完成。
细胞外基质（ECM）具有多种重要功能。首先，它能够提供复杂的纳米级的结构蛋白架构（如胶原、层纤连蛋白和纤连蛋白），构建细胞微环境中的机械特性。细胞通过表面整合素感受机械力，并结合ECM蛋白，粘附模体。3D系统的细胞粘附会导致并影响一系列的的后续细胞反应，这些反应和2D表面上生长的细胞相比更接近于生理情况。而且，ECM对隔绝可溶性生物分子和生长因子，通过时间和空间上的限制来控制这些信号分子的释放来指导包括细胞迁移、基质降解和沉积的过程至关重要。
ECM模型重构对于实现组织内稳态，尤其是在发育和疾病过程中，是非常必要的。因此，想要真正地模拟体内的ECM，需要构建具有ECM机械和化学特性的3D培养模型，要考虑到细胞生长和发育的动态和可控过程，而不只是停留在细胞接种的初级阶段。
CorningMatrigel是来源于ECM的天然水凝胶，已广泛运用于各种体外和体内3D细胞培养中。这种重构的基底膜提取自EHS（Engelbreth-Holm-Swarm）小鼠肉瘤，含有基底膜中所有常见的ECM分子（包括层纤连蛋白、IV型胶原、肝素硫酸蛋白聚糖和巢蛋白）。Matrigel胶的ECM成分能够激活癌症细胞中的多条信号通路，这些通路控制着血管生成、癌细胞运动和药物敏感性。
I型胶原是另一种常用的3D细胞培养天然水凝胶。I型胶原是间质隔室和骨中常见的ECM分子。可分离自多种生物来源，包括牛皮、大鼠尾腱和人胎盘。I型胶原还可以静电纺丝为膜，并帮助细胞进行3D生长于分化。除此以外，I型胶原和整合素受体相互作用，调节基因表达。
天然水凝胶也存在缺陷，如从动物来源，以及成分上的批次间差异。而且，它们包含着像生长因子这样的内源生物活性成分，虽然有利于构建一些3D模型，但有些情况下也会混淆所特定的细胞表现或反应。
为了避免随动物来源生物材料的弊端，研发出不含动物来源或利用重组核酸技术而来的基质。透明质酸（HA）是一种越来越受欢迎的生物基质。多数商业级的HA来源于细菌，高纯度且同质性高。这些凝胶可通过加入ECM成分来改造，促进细胞粘附和生长。