机体在遭受外源性病毒或者细菌入侵后，往往会伴随有感染性休克的症状进而威胁病人的生命安全。经典的理论认为体内的巨噬细胞产生大量的炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等形成的“炎症风暴”是导致休克的重要诱因。但是，临床统计学研究却表明二者之间的相关性只有39%。另一方面，近些年来细胞焦亡这样一种新型细胞程序性死亡也被多篇文章报道参与了感染性休克的发生发展中，而在感染性休克的进程中，除了这些细胞焦亡或者炎症信号外，合并产生的多种并发症如在病理情况下内源性物质代谢紊乱所造成的物质蓄积加重感染性休克进程的作用和确切分子机制仍然不明。
近日，中国药科大学的郝海平团队在CellMetabolism杂志上在线发表了题为：Apaf-1PyroptosomeSensesMitochondrialPermeabilityTransition的研究论文，该研究从线粒体膜通透性转换（MPT）的角度揭示了肝细胞、免疫细胞感知DAMPs促发细胞焦亡的病理分子机制，首次揭示线粒体感知不同应激条件下，通过Apaf-1选择性招募活化caspase-4引发细胞死亡的机理。相较于MOMP引发的经典细胞凋亡小体（Apaf-1/Caspase-9）组装，MPT促使Apaf-1与Caspase-4结合形成一种新的蛋白复合体，作者将之定义为“焦亡小体复合物”，该复合物可进一步激活caspase-3-GSDME信号通路导致快速的细胞焦亡，这种快速的细胞死亡途径是胆淤状态下肝衰竭的重要分子病理基础。该研究发现了一种新型线粒体细胞焦亡途径，为线粒体感知损伤相关模式分子（DAMPs）引发细胞焦亡提供了科学解释，拓宽了对于肝衰竭疾病发生机制的认识，对将来药物干预感染合并胆淤病人肝功能损伤有重要意义。
胆汁酸引发caspase-4以及GSDME依赖性的细胞焦亡
在该研究中，作者首先运用细胞毒性/炎症因子释放检测、透射电镜、共聚焦显微镜观察细胞形态学变化等多种手段，发现胆汁酸DCA（脱氧胆酸）/CDCA（鹅去氧胆酸）能够诱导caspase-4（caspase-11,鼠源蛋白）介导的巨噬细胞焦亡，进一步探究表明，细胞焦亡执行分子由caspase-3作用底物GSDME所介导，而非caspase-4的作用底物GSDMD，并且caspase-3/GSDME信号也依赖于caspase-4，进而发现了胆汁酸激活的一种新的细胞焦亡途径，该途径由caspase-4/caspase-3/GSDME信号通路介导。
MPT介导胆汁酸引发的细胞焦亡信号
那么，在胆汁酸的刺激下，细胞内caspase-4又是怎样被激活的？作者首先排除了胆汁酸与caspase-4的直接相互作用，提示胆汁酸以间接的方式激活caspase-4以及caspase-3-GSDME信号。考虑到线粒体应激在调控细胞凋亡以及坏死中的作用，尤其是高浓度胆汁酸可能会引发线粒体钙超载现象导致线粒体膜通透性发生变化产生应激。作者首先筛选了线粒体膜通透性转化孔（MPTP）关键组成蛋白的抑制剂，发现有且只有线粒体内膜腺苷酸转运体(ANT)蛋白的抑制剂米酵菌酸（BKA）能够显著阻断上述焦亡信号通路以及最终的细胞焦亡现象，作者进一步将ANT亚型ANT1和ANT2蛋白敲低，证实了ANT1介导的MPT是胆汁酸激发细胞焦亡信号的关键因素。
MPT通过Apaf-1/caspase-4蛋白复合体引发细胞焦亡
接下来，作者发现在MPT所引发的线粒体应激下，线粒体瞬时释放较高浓度的ATP以及细胞色素C至胞浆，是促使Apaf-1招募caspase-4形成“焦亡小体复合物”的关键因素。Co-IP、pull-down、confocal共定位实验均证实Apaf-1与caspase-4在高剂量胆汁酸刺激下产生了相互作用，敲除细胞内Apaf-1基因，caspase-4/caspase-3/GSDME信号通路及细胞焦亡率均受到显著抑制。此外，作者在重组蛋白分子水平也证实，在外源性加入细胞色素C与高剂量的ATP后，Apaf-1能够结合并活化caspase-4。有意思的现场是，该焦亡复合体中产生的活化caspase-4片段并不能剪切GSDMD，而是剪切激活caspase-3，这也解释了上述细胞内观察到现象：为什么胆汁酸激活caspase-4介导的细胞焦亡是通过GSDME蛋白执行的。进一步通过最适分子配比酶活性检测以及分子排阻色谱（SEC）实验发现“焦亡小体”复合体中Apaf-1与caspase-4的构成比为7：2，不同于凋亡小体中的7：4。考虑到Apaf-1也是细胞凋亡中凋亡小体Apaf-1/caspase-9的核心组成成分，作者进一步通过动态监测不同的细胞死亡刺激条件下caspase蛋白活化、胞浆细胞色素C与ATP释放水平，发现高剂量胆汁酸或者ANT1通道开放剂氯尼达明（LND）等MPT激活剂可以在短时间内激活焦亡相关的caspase-4、caspase-3，而凋亡诱导剂阿霉素（DOX）或者低剂量的胆汁酸只能引发经典的细胞凋亡，这些弱刺激因素需在较长时间条件下才能激活caspase-9，而且细胞色素C释放延滞，胞浆中无明显的ATP释放峰。这部分研究提示，不同的应激因素通过促发线粒体MOMP或者MPT，从而选择性激活细胞凋亡/焦亡信号通路，而MPT及下游Apaf-1/caspase-4焦亡小体的形成需要更强烈的刺激。
Caspase-11/caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡是胆汁淤积性肝损伤的关键病理机制
最后，为进一步证实上述分子机制在急性肝损伤中的作用，该团队利用胆管结扎手术（BDL）造成肝内胆汁淤积来模拟胆瘀相关的急性肝衰竭。研究发现胆汁淤积后，小鼠肝脏组织线粒体也发生了MPT，表现为线粒体內嵴结构消失。进一步比较野生型（WT）与Caspase-11-/-小鼠血清中炎症因子IL-1α/β以及肝组织中caspase-3-GSDME信号通路均证实BDL模型所造成的肝损伤依赖于caspase-11（对应于人源蛋白caspase-4）。与此同时，GSDME-/-也能够抑制小鼠血清相关因子的释放，几乎能逆转急性胆汁淤积性肝衰竭的致死率。
综上，该研究揭示了感染合并胆汁淤积或者在非感染性情况下，内源性物质激活细胞焦亡造成组织器官衰竭的新分子机制；Apaf-1/caspase-4焦亡小体的发现一方面科学解释了MPT引发细胞坏死的分子机制，另一方面对于理解内源性非感染因素促发器官衰竭具有重要意义。此外，对后期开发细胞焦亡抑制剂，用于临床上由于细胞焦亡所造成的器官组织衰竭的药物治疗具有重要应用价值。
中国药科大学郝海平教授、曹丽娟副研究员为本文的共同通讯作者，许万峰博士、车远博士为本文的共同第一作者。
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