胶质母细胞瘤(GBM)是最致命的脑癌类别，原因在于其定位长期存在问题，且GBM的治疗极具挑战性，因为许多药物无法有效地穿过血脑屏障（BBB），并且肿瘤常常难以浸润操作的大脑区域，并且手术期间的肿瘤边缘界定通常不准确。嵌合抗原受体(CAR)T细胞免疫疗法已成为治疗癌症的有力策略。IL-13-受体-α2（IL13Rα2）存在于超过75%的GBM中，已被公认为抗胶质母细胞瘤治疗的理想候选者。
宾夕法尼亚州立大学生物医学工程系和赫尔希医学中心的研究团队在期刊《BioactiveMaterials》上发表了名为《High-affinitymutantInterleukin-13targetedCARTcellsenhancedeliveryofclickablebiodegradablefluorescentnanoparticlestoglioblastoma》的文章，探究利用CART细胞免疫疗法，开发将治疗性纳米颗粒和T细胞靶向递送至实体瘤的可能。文中应用EchoRevolve正倒置一体显微镜进行免疫荧光的显微成像。
在此，作者提出了一种新的多学科方法来靶向脑肿瘤，该方法使用荧光、治疗性纳米颗粒和用IL13的靶向四重突变体（TQM-13）进行修饰的CART细胞的组合，显示对表达IL13Rα2的胶质母细胞瘤具有高结合亲和力、非靶向毒性低的特点。纳米颗粒与T细胞表面的叠氮化物-炔烃环加成共轭使得纳米颗粒的点击变得容易、有选择性和高产。点击T细胞上的纳米颗粒被保留至少8天，表明这种连接是稳定的，有望为体内给药提供一个合适的时间窗口。与裸T细胞相比，用负载多柔比星的纳米颗粒点击的T细胞在体外显示出更高的细胞毒性作用。与单独使用纳米颗粒相比，表达TQM-13的体外和体内T细胞充当纳米颗粒的递送梭，并显著增加了到达脑肿瘤的纳米颗粒数量。这项工作代表了一个新平台，可以将治疗性纳米颗粒和T细胞递送至实体瘤。
作者利用点击化学的方法，用BPLP-PLA-NPs（可生物降解的耐光漂白荧光聚丙交酯共聚物纳米颗粒）修饰T细胞。为了验证其效率，使用流式细胞术和免疫荧光对T细胞、T细胞+BPLP-PLA-NPs（非特异性结合）和T细胞+BPLP-PLA-NPs（点击）的三组样本进行检测，发现BPLP-PLA-NPs的效率非常高。
其中免疫荧光结果由ECHORevolve显微镜进行成像，成像照片绿色荧光清晰显示了三组间的荧光差别，单色照片可准确获得其荧光强度。
图2.点击BPLP-PLA-NPs到T细胞上。(A)T细胞、T细胞+BPLP-PLA-NPs（非特异性结合）和T细胞+BPLP-PLA-NPs（点击）的SEM显微照片。(B)T细胞、T细胞+BPLP-PLA-NPs（非特异性结合）和T细胞+BPLP-PLA-NPs（点击）的流式细胞术数据和荧光显微照片。(C)面板B中三组的绿色荧光直方图。(D)面板B中三组的绿色荧光强度量化结果代表平均值±SEM。(E)图B中三组用NP标记的细胞百分比。
通过可酸裂解的肼（联氨）键连接BPLPPLANP可以有效地增强阿霉素的传递，因为肼键可以在肿瘤微环境的弱酸性条件下被裂解，从而释放出游离的BPLPPLA-NP。通过流式细胞术分析BPLP-PLA-NPs对T细胞的点击以及对1、2、4、8天点击T细胞荧光强度的测量（由EchoRevolve显微镜采集荧光图像），可以发现点击到的T细胞上的BPLP-PLA-NPs至少可以保留8天，表明肼键在生理条件下是稳定的。
图3.BPLP-PLA-NPsclickedT细胞的稳定性和荧光表征。(A)流式细胞仪分析T细胞和T细胞+BPLP-PLA-NPs荧光的时程监测（点击）。(B)T细胞和T细胞+BPLP-PLA-NPs(点击)的绿色荧光强度量化。
所提出的药物递送方法依赖于T细胞在BPLP-PLA-NP点击后执行其正常生理功能的能力。细胞必须能够与内皮相互作用并迁移穿过血脑屏障，才能将它们携带的药物运送到位于大脑中的实体瘤。
为了评估T细胞通过BBMVECs的迁移功能，作者使用BBMVECs和星形胶质细胞在多孔膜上成功建立了体外BBB模型。利用ECHORevolve显微镜进行荧光显微成像，显示BBB模型成功建立（图4C）。BBB模型的屏障功能通过测量FITC-DextranMW40kDa穿过屏障的扩散来确认（图4D)。通过对不同处理的样本迁移情况的比对，发现迁移细胞的百分比在用BPLP-PLA-NPs点击后没有显著变化。这表明BPLP-PLA-NPs不会改变T细胞外渗通过BBB并靶向癌细胞的能力。
图4.点击BPLP-PLA-NPs后，免疫细胞的正常生理功能不会改变。(A)8天内T细胞和T细胞+BPLP-PLA-NPs（点击）的增殖。(B)T细胞和T细胞+BPLP-PLA-NPs(点击)在BBMVECs单层上形成的间隙。(C)荧光显微照片，体外BBB模型的动画图。(D)FITC-DextranMW40kDa在BBB模型中的扩散量化。(E)对在体外响应CXCL-12迁移的T细胞和T细胞+BPLP-PLA-NPs（点击）进行量化（下）。
为了有效地将BPLP-PLA-NPs递送到胶质母细胞瘤中，作者使用了基因修饰的TQM-13-CART细胞。为了证明TQM-13-CART细胞可以在体内进入肿瘤，在转导后，通过尾静脉注射将TQM-13-CART细胞施用于裸鼠（图7C）。注射后24小时处死小鼠。收集大脑并进行免疫组化处理。脑切片分别用Ki67和CD3染色用于肿瘤和T细胞检测（图7D-F)。使用ECHORevolve显微镜清晰地在肿瘤内观察到TQM-13-CAR修饰的T细胞。作为比较，也注射了未转导的T细胞，但在肿瘤中未检测到它们（图7G-H)。
图7.TQM-13CAR-T细胞浸润小鼠颅内肿瘤。(A)展示了将小鼠放置在其中用于准备颅内模型的外科手术的立体定位设置。(B)展示颅内注射U87Luc细胞的设置。(C)展示用TQM-13CAR-T细胞尾部注射的裸鼠。(D–H)这些是使用u87细胞建立肿瘤的小鼠颅内肿瘤模型的一系列代表性图像。(D)用Ki67染色证明在脑内建立了增殖性肿瘤。(E)证明注射后24小时肿瘤中存在人类T细胞(用CD3检测)。(F)D和E的叠加表明TQM-13CAR-T人类T细胞存在于肿瘤内。(G–H)显示来自接受未转导T细胞的荷瘤小鼠的切片。(G)用Ki67染色证明在脑内建立了增殖性肿瘤。(H)表明注射后24小时在肿瘤中未检测到未转导的人类T细胞。
通过对小鼠颅内模型中，BPLP-PLANPs点击的TQM-13CAR-T修饰细胞浸润肿瘤组织的研究，使用ECHORevolve显微镜对免疫荧光结果的观察成像，表明了负载NP的TQM-13-CART细胞有可能将治疗药物输送到实体瘤中（图8）。
图8.在小鼠颅内模型中，用BPLP-PLANPs点击的TQM-13CAR-T修饰细胞浸润肿瘤组织。(A)用KI67染色证明在脑内建立了增殖性肿瘤。(B)表明在静脉注射TQM-13CAR-T后肿瘤中存在荧光标记的BPLP-PLANP，并点击BPLP-PLANP细胞。(C)证明肿瘤中存在TQM-13CAR-T人类T细胞。(D)B和C的叠加表明用BPLP点击的TQM-13CAR-T细胞与人类T细胞相关。(E)确认点击TQM-13CAR-T细胞的BPLP-PLANP被递送至颅内肿瘤。(F)表明当注射NP而不点击T细胞时，肿瘤中没有可检测到的NP。
以上的免疫荧光图像均由EchoRevolve正倒置一体荧光显微镜拍摄，作为一款电动化、智能化的显微镜，具有以下优势：
简单快速的电动化双相机切换、荧光组件切换及Z轴调整代替了费时繁琐的人工操作切换；
拥有强大的Z-Stacking和DHR功能，通过高精度电动化Z轴层扫来扩大景深，通过DHR降低背景噪音，解决厚样本观察问题，提高图像分辨率；
具有多通道荧光自动拍摄叠加功能，可自动进行多通道成像的叠加，个性化选择查看/保存各通道的组合图像。
研究者最终建立了新的系统用于后续脑癌治疗的研究中，该方法与传统脑癌化疗相比，具有以下优势：
1）通过将抗肿瘤药物封装在可生物降解的聚合物NP中，降低了全身毒性，并在靶部位实现了更高的药物生物利用度；
2）提供了一种方便、高效的单步点击NP到T细胞表面的方法；
3）利用人类T细胞作为活性药物载体或背负装置，增强治疗性NP的靶向递送；
4）利用高亲和力TQM-13CART细胞，特异性靶向并杀死脑癌细胞；
5）在酸性肿瘤微环境中，通过其pH敏感连接物，从细胞中裂解并释放NP。
并且这种细胞和纳米粒子递送平台技术有望成为影响多学科的重要工具（包括免疫学、药物传递、生物材料，以及癌症生物学），并促进癌症治疗和再生医学的细胞疗法的发展。