撰文
十一月
#癌症#
利用患者体内T细胞进行细胞治疗已经开始彻底改变几种癌症的治疗方法。然而这些细胞治疗的方法还需要进一步提高反应效率和治愈率。但迄今为止关于T细胞功能的研究主要是功能缺失性的负调控因子的研究，但是由于基因组的永久性改变引发了人们对于这些研究应用安全性方面的担忧。
年3月16日，美国纽约基因组研究中心NevilleE.Sanjana研究组以及MateuszLegut（第一作者）合作在Nature上发表文章Agenome-scalescreenforsyntheticdriversofTcellproliferation，利用全基因组大规模筛选的方式寻找促进T细胞功能的正向调控因子。
到目前为止，美国食品和药物管理局已经批准了5种嵌合抗原受体（ChimericantigenReceptors，CARs）用于血癌的治疗。但是由于肿瘤微环境中T细胞效应因子功能的抑制，嵌合抗原受体用于实体肿瘤的治疗效果并不好。但目前关于T细胞功能的调节因子主要是在于全基因组的功能缺失筛选。CRISPR-Cas9基因编辑方法促使大规模筛选变得更加便捷，但这些方法大多都依赖于Cas9蛋白或mRNA的瞬时传递，这在人体细胞功能获得性筛选中并不适用。所以作者们使用条形码人类基因组开放阅读框慢病毒文库，对人类CD4+和CD8+T细胞进行了基因组规模的功能获得性筛选（图1）。作者们所使用的慢病毒文库中包含近12,个全长基因，每个基因大约有6个条形码。作者们将慢病毒转导到捐赠者来源的CD4+和CD8+T细胞之中，经过一段时间培养后重新刺激细胞，从中识别对T细胞受体反应的驱动因素。
图1人类CD4+和CD8+T细胞全基因组功能获得性筛选
通过该大规模筛选，作者们发现MAPK3、CD59、转录因子BATF以及IL12B和IL23A等细胞因子会促进T细胞增殖（图1）。为了确认汇总中排名靠前的人类基因开放阅读框的可信度，作者们通过基因条码对给定基因的富集情况进行鉴定，发现大多数基因的开放阅读框的条码都会在T细胞增殖的群体中富集，该结果说明这一筛选结果并非是由于虚假的克隆过增长或者PCR引入的偏差所引起的。通过对富集的基因进行基因本体分析发现，这些基因跨越了多种多样的生物学过程以及相关信号通路，比如淋巴细胞增殖、干扰素-γ的产生和NF-κB信号转导等。
为了进一步对筛选结果进行验证，作者们决定广泛测试这些开放阅读框与T细胞适应性相关的不同途径中发挥作用的模式（图2）。为此，作者们从文库中克隆了33个开放阅读框到载体中，并且以神经生长因子受体短截片段作为对照，该受体片段过表达对T细胞表型没有影响。首先，作者们通过流式细胞分选证实这些开放阅读框在CD4+和CD8+两个T细胞亚群中均稳定、一致表达。随后，在重新刺激细胞后，作者们发现与对照相比，其中有16个基因会显著提高T细胞增殖能力，也会促进T细胞激活标记物的表达、促进细胞因子的分泌。
图2单个开放阅读框对T细胞功能影响的测试流程
这些筛选结果中，有一个基因引发了作者们的研究兴趣，该基因是淋巴细胞毒素β受体LTBR。之所以令人惊讶是因为该基因在基质细胞和骨髓细胞中广泛表达，但是在淋巴细胞中其实完全不存在。在对LTBR进行克隆并在CD4+和CD8+两个T细胞亚群表达后，作者们观察到对T细胞功能增强的效果最为明显，它使得CD4+和CD8+T细胞中多种细胞因子的分泌增加了5倍以上。
随后，作者们决定更加详细地研究LTBR的作用机制。通过RNA-seq，作者们与对照组对比LTBR过表达后所引起的T细胞功能改善的机制。作者们发现LTBR过表达会促进MHC-I和MHC-II基因的上调，同时也会激活NF-κB通路以及强烈地上调BATF3，该因子能促进CD8+T细胞的存活。作者们还观察到参与白介素产生相关的关键转录因子JUNB以及负责T细胞自我更新的关键转录因子TCF7的上调。这些结果说明LTBR的过表达显著改善T细胞的功能。进一步的，通过对LTBR中关键基因片段的分析作者们发现LTBR的C端对其发挥功能更为关键。
随后，作者们希望检测该筛选鉴定到的因子能否应用于细胞治疗的优化和开发。有效的抗肿瘤T细胞的一个重要特征是在慢性抗原暴露的情况下保持功能。作者们发现表达LTBR的CAR-T细胞比表达对照组的CAR-T细胞在目标细胞重复刺激后显示出更好的功能，而且过表达LTBR并不会引起虚假的、抗原无关的反应。
总的来说，作者们通过全基因组大规模开放阅读框文库的过表达筛选到了多种促进T细胞功能的正向调节因子，这些基因会增加人类CD4+和CD8+T细胞的增殖和激活以及关键细胞因子的分泌，为优化和改善T细胞治疗提供新的策略。
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